Fortschritte bei der Therapie mit humanen monoklonalen Antikörpern gegen HBV-Infektionen

Die nächste Generation humaner therapeutischer monoklonaler Antikörper (t-mAbs) ist mit der weit verbreiteten Bottom-up-Methode des tryptischen Verdaus schwieriger zu quantifizieren. Aufgrund ihrer Homologie mit körpereigenen Immunglobulinen fehlt es an einzigartigen und stabilen „Signatur“-Peptiden, die gezielt eingesetzt werden können. Als Alternative wurde die zweidimensionale Flüssigchromatographie mit hoher Auflösung (2D-LC-HRMS), die auf die gesamte leichte Kette abzielt, untersucht.

Adalimumab (ADM) wurde erfolgreich in menschlichem Plasma nach einer Melon-Gel-Probenreinigung und anschließender orthogonaler Trennung auf einer schwachen Kationenaustausch- (WCX) und Umkehrphasensäule quantifiziert. Ladung und Hydrophobizität wurden genutzt, um ADM vom polyklonalen Immunglobulinhintergrund zu trennen. Die HRMS mit ihrer hohen Auflösung und exakten Masse war in der Lage, die leichte Kette von ADM isotopisch aufzulösen und eine weitere Trennungsdimension auf der Grundlage des Masse-Ladungs-Verhältnisses zu liefern. Unter Verwendung der gezielten Einzelionenüberwachung (T-SIM) mit Multiplex-Option (MSX) wurden drei ADM-Leichtkettenvorläufer, 2341,80, 2129,00 und 1951,68 m/z, und ein interner Standardvorläufer 2146,39 m/z, gleichzeitig gemessen. Die Probenreinigung mit Melon Gel erwies sich als sehr effizient bei der Entfernung von Plasmaproteinen, die andernfalls die chromatographische Trennung und Ionisierung stören würden.

Die Linearität der Methode für die Analyse von ADM war hervorragend (R2=0,999) zwischen 1 – 128 mg/L mit einem LLOQ-Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) von 10. Die Präzision und Genauigkeit innerhalb und zwischen den Durchläufen entsprachen der EMA-Richtlinie. Die Kreuzvalidierung der 2D-LC-HRM-Methode mit der Standard-Peptid-LC-MS/MS-Methode zeigte eine gute Übereinstimmung (R2 = 0,86) zwischen den Methoden. Allerdings gab es eine Verzerrung, die möglicherweise auf die Bildung von ADM-Ladungsvarianten im Laufe der Zeit zurückzuführen ist. Da die vorgestellte 2D-LC-HRMS-Methode nur die native Form von ADM messen kann, ist sie in der Lage, die aktive Form von ADM bei Patienten zu messen.

Neutralisierende HBV-Antikörper zielen auf die viralen Hüllantigene (HBsAg) ab und verleihen Impfgeschädigten und infizierten Menschen, die eine Serokonversion durchlaufen, einen langfristigen Immunschutz.

  • Sie erkennen verschiedene HBsAg-Epitope und können mit Fc-abhängigen Effektor-Funktionen ausgestattet werden, die für die Eliminierung infizierter Zellen und die Stimulierung der adaptiven Immunität wichtig sind.
  • Hunderte von HBsAg-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) wurden seit den frühen 80er Jahren hergestellt, aber erst in jüngster Zeit wurden echte humane Anti-HBV-mAbs von Impflingen und Serokonvertern generiert. Neutralisierende HBV-MAbs haben in Tiermodellen eine prophylaktische und therapeutische Wirksamkeit in vivo und sind in der Lage, Antigenämie und Virämie bei infizierten Menschen zu verringern.
  • Somit bieten polyfunktionale, potente und breit einsetzbare neutralisierende mAbs gegen HBV neue Möglichkeiten zur Entwicklung wirksamer Maßnahmen zur Prävention und Behandlung von HBV-Infektionen. Hier fassen wir die jüngsten Erkenntnisse über die humorale Immunantwort auf HBV zusammen und untersuchen das Potenzial humaner HBV-neutralisierender mAbs als Immuntherapeutika, um eine funktionelle Heilung von HBV zu erreichen.
  • Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind erfolgreiche Biomedizinprodukte; die Bewertung ihrer Pharmakokinetik und Pharmakodynamik erfordert jedoch eine hochspezifische Unterscheidung von natürlich im gentaur Blut vorhandenem menschlichen Immunglobulin G.
  • Hier haben wir ein neuartiges Anti-Idiotyp-Aptamer (A14#1) mit außergewöhnlicher Spezifität gegen den therapeutischen mAb gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, Bevacizumab, entwickelt. Die Strukturanalyse des Antikörper-Aptamer-Komplexes zeigte, dass mehrere Basen von A14#1 nur die komplementäritätsbestimmende Region (CDR) von Bevacizumab erkennen, was zu seiner außergewöhnlichen Spezifität beiträgt. Da die CDR von Bevacizumab unter leicht sauren Bedingungen vermutlich stark positiv geladen ist und die DNA negativ geladen ist, war die Affinität von A14#1 zu Bevacizumab bei pH 4,7 (KD = 44 pM) deutlich höher als bei pH 7,4 (KD = 12 nM).
  • So wurde eine elektrochemische Nachweismethode auf der Basis von A14#1 entwickelt, die 31 pM Bevacizumab bei pH 4,7 nachweisen kann. A14#1 könnte als neuartiger Ligand von Bevacizumab potenziell für die Messung therapeutischer Wirkstoffe nützlich sein.

Cemiplimab ist ein hochwirksamer, gelenkstabilisierter humaner monoklonaler IgG4-Antikörper (mAb), der auf den Rezeptor für den programmierten Zelltod 1 (PD-1) abzielt.

Kürzlich wurde Cemiplimab in der Phase-3-Studie EMPOWER-Cervical 1 bei Patienten mit rezidiviertem/metastasiertem Gebärmutterhalskrebs untersucht. Bei der Zwischenanalyse sprachen das Gesamtüberleben (OS), das progressionsfreie Überleben (PFS) und die objektive Ansprechrate (ORR) in der Gesamt- und SCC-Population für Cemiplimab gegenüber einer Monotherapie. Gebärmutterhalskrebs steht an erster Stelle der mit dem Humanen Papillomavirus (HPV) in Zusammenhang stehenden Neoplasien und korreliert in hohem Maße (etwa 95 %) mit der Virusinfektion. In ähnlicher Weise können sich penile und vulväre SCC bei chronischen HPV-Infektionen oder bei chronischen dermatologischen Erkrankungen (z. B. Flechten) entwickeln. Die molekularen und viralen Ähnlichkeiten zwischen SCC im äußeren Genitalbereich und SCC, der vom Gebärmutterhalsepithel ausgeht, könnten der Grund dafür sein,

Cemiplimab auch zur Behandlung von lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem penilem und vulvärem SCC einzusetzen. Einige retrospektive Daten haben gezeigt, dass Cemiplimab bei einigen Patienten mit penilem oder vulvärem SCC ein objektives Ansprechen und einen klinischen Nutzen bewirken kann und insgesamt sicher in der Anwendung bei dieser Patientengruppe ist. Angesichts der Komplexität der Immunaktivierung und der beträchtlichen Variabilität in der Tumorbiologie bei verschiedenen Patienten und Tumorarten muss die Identifizierung von Biomarkern, die die Patientenauswahl gewährleisten, weiter erforscht werden. Laufende klinische Studien werden hoffentlich auch das Behandlungsparadigma für diese seltenen Tumoren erhellen, insbesondere im Hinblick auf die ideale Kombination und Abfolge von immuntherapeutischen Strategien.

Monoklonale Antikörper (mAbs) stellen eine wichtige Kategorie biopharmazeutischer Produkte dar,

die aufgrund ihres Erfolges als Therapeutika in jüngster Zeit das Aufkommen von mAbs aus verschiedenen Arten des Traffics erlebt haben. Wir berichten über die Entwicklung einer analytischen Strategie, die die strukturelle Identifizierung von mAbs sowie eine umfassende Charakterisierung und Quantifizierung von Proben in potenziell gefälschten Proben ermöglicht. Die Strategie basiert auf dem gleichzeitigen Einsatz der Kapillarzonenelektrophorese-Analyse (CZE-UV), der Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit der Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) und der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit der Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Diese Analysestrategie wurde bei der Untersuchung verschiedener Proben unbekannter Herkunft angewandt, die von den Behörden beschlagnahmt worden waren und möglicherweise ein IgG 4 oder ein IgG 1 enthielten.

Die mit den verschiedenen Techniken erzielten Ergebnisse lieferten orthogonale und ergänzende Informationen über die Art und die Struktur der verschiedenen mAbs. Sie ermöglichten es daher, die mAbs in den potenziell gefälschten Proben zweifelsfrei zu identifizieren. Schließlich wurde eine LC-MS/MS-Quantifizierungsmethode entwickelt, deren Spezifität darin bestand, verschiedene mit stabilen Isotopen markierte mAbs als internen Standard einzubeziehen. Die LC-MS/MS-Quantifizierungsmethode wurde validiert und zeigte so die Möglichkeit, gängige Peptide mit dem betrachteten IgG zu verwenden, um eine Bestimmungsgrenze von nur 41,4 nM zu erreichen. Die Quantifizierungsmethode wurde verwendet, um die Konzentration in den untersuchten Proben unter Verwendung eines einzigen Typs von internem Standard und experimentellen Bedingungen zu schätzen, selbst im Falle von mAbs, für die keine stabilen isotopenmarkierten Homologe verfügbar sind.

 

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