Die nekrotische Streifenkrankheit des Fique (Furcraea spp.) oder „Macana“-Krankheit gilt als die am stärksten einschränkende Krankheit für diese Kulturpflanze in Kolumbien, deren Erreger das Furcraea Necrotic Streak Virus – FNSV (RNA+) ist. Derzeit gibt es keine Strategien zur Bekämpfung der Krankheit, so dass es notwendig ist, Methoden zum Nachweis dieses Erregers im Pflanzmaterial zu entwickeln, bevor es auf das Feld gebracht wird. In dieser Studie wurden polyklonale, in Eigelb produzierte Antikörper (IgY) hergestellt und für den Nachweis von FNSV bewertet. Zwei immunoenzymatische Methoden wurden standardisiert: Dot Blot Immunobinding Assay (DBIA) und Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), um ihre Spezifität und Empfindlichkeit zu bestimmen. Die Nachweisgrenze beim DBIA lag bei 8 μg/ml gereinigter Virussuspension unter Verwendung von 10 μg/ml Primärantikörper. Im ELISA-Test wurde das Antigen bei einer Primärantikörperkonzentration von 3 μg/ml (1:800 Verdünnung) in Konzentrationen zwischen 10 und 70 μg/ml nachgewiesen. Der polyklonale Antikörper anti-FNSV IgY ermöglichte den Nachweis von FNSV in Proben von gereinigtem Virus und Extrakten von Wurzeln und Blättern von Fikumpflanzen mit Symptomen der „Macana“-Krankheit und erzeugte kein Signal bei den Kontrollproben. Die Ergebnisse zeigen das Potenzial der Verwendung von Eigelb-IgY in immunologischen Tests zum Nachweis von FNSV in Fikuspflanzen.
Die nekrotische Streifenkrankheit der Fique (Furcraea spp.) oder „Macana“-Krankheit gilt als die am meisten einschränkende Krankheit für diese Kultur in Kolumbien, deren Erreger das Furcraea Necrotic Streak Virus – FNSV (RNA+) ist.
- Derzeit gibt es keine Strategien zur Bekämpfung der Krankheit, so dass es notwendig ist, Methoden zum Nachweis dieses Erregers im Pflanzmaterial zu entwickeln, bevor es auf das Feld gebracht wird. In dieser Studie wurden polyklonale, in Eigelb produzierte Antikörper (IgY) hergestellt und für den Nachweis von FNSV bewertet.
- Zwei immunoenzymatische Methoden wurden standardisiert: Dot Blot Immunobinding Assay (DBIA) und Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), um ihre Spezifität und Empfindlichkeit zu bestimmen. Die Nachweisgrenze beim DBIA lag bei 8 μg/ml gereinigter Virussuspension unter Verwendung von 10 μg/ml Primärantikörper.
- Im ELISA-Test wurde das Antigen bei einer Primärantikörperkonzentration von 3 μg/ml (1:800 Verdünnung) in Konzentrationen zwischen 10 und 70 μg/ml nachgewiesen. Der polyklonale Antikörper anti-FNSV IgY ermöglichte den Nachweis von FNSV in Proben von gereinigtem Virus und Extrakten von Wurzeln und Blättern von Fikumpflanzen mit Symptomen der „Macana“-Krankheit und erzeugte kein Signal bei den Kontrollproben. Die Ergebnisse zeigen das Potenzial der Verwendung von Eigelb-IgY in immunologischen Tests zum Nachweis von FNSV in Fikuspflanzen.
- Das Zellwand-Mannoprotein (MP1)-Gen eines aus gelagerten Weizenkörnern isolierten aflatoxigenen Stammes von Aspergillus flavus wurde kloniert und sequenziert. Das MP1-Protein wurde in E. coli in löslicher Form exprimiert und gereinigt. Polyklonale Antikörper wurden gegen rekombinantes MP1-Protein und inaktivierte Sporen dieses Pilzes in Kaninchen gezüchtet und contact gentaur durch Ammoniumsulfat-Fällung, Protein-A-Sepharose und Antigen-Affinitätschromatographie gereinigt.
- Die Mindestkonzentration der gereinigten Myzel- oder Sporenproteine, die im ELISA nachgewiesen werden konnte, wurde mit 100 ng unter Verwendung von 2 µg dieser Antikörper bestimmt. Der Anti-MP1-Antikörper erwies sich als empfindlicher als der Anti-Sporenprotein-Antikörper.
- Western-Blot- und Immunfluoreszenz-Analysen zeigten die Reaktivität dieser Antikörper gegenüber verschiedenen Proteinen (30 bis 200 kDa), die auf der Oberfläche von Myzelien und Sporen von A. flavus verteilt sind. Eine Kreuzreaktivität dieser Antikörper wurde mit Pilzen verschiedener Aspergillus-, Rhizopus- und Alternaria-Spezies aus vierzehn verschiedenen getesteten Pilzarten festgestellt. In pilzkontaminierten Weizenkörnern konnten diese Antikörper mittels ELISA das Vorhandensein von nur 1 µg Myzelien oder 103 Sporen pro Gramm Weizenkörner nachweisen.
- Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entwickelten Antikörper erfolgreich für den Nachweis von vorherrschendem Pilzbefall in gelagerten Weizenkörnern eingesetzt werden können.
Ein koreanisches Isolat des Sacbrood-Virus, das Apis cerana infiziert (AcSBV-Kor), ist das zerstörerischste Honigbienenvirus, das in der koreanischen Imkerei schwere wirtschaftliche Schäden verursacht.
Aus diesem Grund haben wir versucht, einen Test zum schnellen Nachweis von AcSBV-Kor zu entwickeln, der auf dem immunchromatographischen Nachweis der einzelnen Virusproteine basiert. Gene, die für VP1- und VP2-Proteine von AcSBV-Kor kodieren, wurden in einen Expressionsvektor (pET-28a) kloniert und in Escherichia coli BL21(DE3) exprimiert. Bei der Aufreinigung wurden rekombinante VP1- (rVP1) und VP2-Proteine (rVP2) in der unlöslichen Fraktion mit einer Molekulargröße von 26,7 bzw. 24,9 kDa gefunden. BALB/c-Mäuse, die mit dem gereinigten rVP1 und rVP2 immunisiert wurden, produzierten polyklonale Antikörper (pAbs) wie pAb-rVP1 und pAb-rVP2. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass pAb-rVP1 stark mit dem homologen rVP1, aber nur schwach mit dem heterologen rVP2 reagierte. Dagegen reagierte pAb-rVP2 nicht nur mit dem homologen rVP2, sondern auch mit dem heterologen rVP1 stark. Milzzellen der immunisierten Mäuse, die mit SP2/0-Ag14-Myelomzellen fusioniert waren, produzierten monoklonale Antikörper (mAbs) wie mAb-rVP1-1 und mAb-rVP2-13.
Western-Blot-Analysen zeigten, dass pAb-rVP1, pAb-rVP2, mAb-rVP1-1 und mAb-rVP2-13 mit AcSBV-infizierten Honigbienen und Larven sowie mit den entsprechenden rekombinanten Proteinen reagierten. Diese Antikörper wurden dann bei der Entwicklung eines schnellen immunchromatographischen (IC) Streifentests verwendet, bei dem kolloidales Gold an pAb-rVP1 und pAb-rVP2 auf dem Konjugatpad und an mAb-rVP1-1 und mAb-rVP2-13 auf der Testlinie gekoppelt ist. Ein Antikörperpaar, pAb-rVP1/mAb-VP1-1, zeigte eine positive Reaktivität von nur 1,38 × 103 Kopien, während das andere Paar, pAb-rVP2/mAb-VP2-13, eine positive Reaktivität von nur 1,38 × 104 Kopien zeigte. Daher wurde das Antikörperpaar pAb-rVP1/mAb-VP1-1 als endgültiger Kandidat für die Validierung ausgewählt. Zur Validierung des AcSBV-Nachweises wurden die IC-Streifentests mit 50 positiven und 50 negativen Proben durchgeführt und mit Echtzeit-PCR-Tests verglichen. Die Ergebnisse bestätigen, dass der entwickelte IC-Test eine ausreichend empfindliche und spezifische Nachweismethode für den benutzerfreundlichen und schnellen Nachweis von AcSBV ist.
Atemwegsinfektionen durch Bakterien des Burkholderia cepacia-Komplexes (Bcc) stellen für Mukoviszidose-Patienten nach wie vor eine Lebensbedrohung dar, da die Lungenfunktion schneller abnimmt und es keine wirksamen Eradikationsstrategien gibt.
Immuntherapien gelten als attraktive Alternative zur Kontrolle und Verringerung der durch diese Infektionen verursachten Schäden. In dieser Arbeit berichten wir über die Klonierung und funktionelle Charakterisierung des OmpA-ähnlichen Proteins BCAL2645, das zuvor identifiziert wurde und sich als immunreaktiv gegenüber Seren von CF-Patienten erwiesen hat, bei denen Bcc-Infektionen nachgewiesen wurden. Das BCAL2645-Protein spielt nachweislich eine Rolle bei der Biofilmbildung, der Anhaftung an Muzine und der Invasion von menschlichen Lungenepithelzellen. Es wurde festgestellt,
dass die Expression des BCAL2645-Proteins in Kulturmedium, das die Lungen von Mukoviszidose-Patienten und die für die Mukoviszidose-Lunge charakteristischen mikroaerophilen Bedingungen nachahmt, erhöht ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ein gegen BCAL2645 gebildeter polyklonaler Antikörper die Fähigkeit von B. cenocepacia K56-2, in vitro CFBE41o- humane Bronchialepithelzellen zu binden und in sie einzudringen, um etwa 75 bzw. 85 % hemmt. Diese Ergebnisse unterstreichen das Potenzial von Anti-BCAL2645-Antikörpern für die Entwicklung passiver Immunisierungstherapien zum Schutz von CF-Patienten vor Bcc-Infektionen.