Polykolonale Antikörper

Einleitung

Antikörper spielen eine zentrale Rolle im Immunsystem, indem sie fremde Substanzen erkennen und eliminieren, die in den Körper eindringen. Ihre wichtigste biologische Funktion besteht darin, an der Immunantwort teilzunehmen, indem sie Krankheitserreger, Toxine und andere körperfremde Moleküle neutralisieren oder entfernen.

Antikörper stellen die humorale Komponente der Immunantwort gegen Antigene dar. Neben der direkten Neutralisierung kann die Bindung von Antikörpern auch andere Immunmechanismen aktivieren, wie beispielsweise die Aktivierung des Komplementsystems oder zelluläre zytotoxische Reaktionen.

Die meisten Antigene besitzen mehrere antigene Determinanten, sogenannte Epitope. Aufgrund dieser strukturellen Vielfalt kann ein einzelnes Antigen von vielen unterschiedlichen B-Lymphozyten erkannt werden. Jede B-Zelle exprimiert einen spezifischen Antikörperrezeptor, der ein bestimmtes Epitop erkennt.

Nach der Aktivierung differenzieren sich diese B-Lymphozyten zu Plasmazellen und beginnen mit der Produktion von Antikörpern gegen das Antigen. Da mehrere B-Zellklone beteiligt sind, wird diese Immunreaktion als polykolonale Antwort bezeichnet. Folglich werden mehrere Antikörper produziert, die unterschiedliche Epitope desselben Antigens erkennen.

Polykolonale Antikörper

Definition

Polykolonale Antikörper sind eine heterogene Mischung von Immunglobulinen, die mehrere Epitope eines einzelnen Antigens erkennen.

Im Gegensatz zu monoklonalen Antikörpern, die von einem einzigen B-Zellklon stammen und nur ein Epitop erkennen, werden polykolonale Antikörper von verschiedenen B-Zellklonen produziert, die während der Immunantwort aktiviert werden.

Die Herstellung polyklonaler Antikörper ist im Allgemeinen schneller, einfacher und technisch weniger aufwendig und dauert in der Regel ein bis zwei Monate. Diese Antikörper weisen häufig eine hohe Avidität auf, da sie gleichzeitig an mehrere Epitope desselben Antigens binden können.

Affinität und Avidität bei Antigen-Antikörper-Interaktionen

Die Qualität und Leistungsfähigkeit von Antikörpern hängen hauptsächlich von zwei Faktoren ab: Spezifität und Bindungsstärke.

Antikörperaffinität

Die Affinität beschreibt die Stärke der Bindung zwischen einer einzelnen Antikörperbindungsstelle (Paratop) und einer spezifischen antigenen Determinante (Epitop).

Diese Bindung ergibt sich aus dem Gleichgewicht zwischen attraktiven und repulsiven molekularen Kräften zwischen Antikörper und Antigen.

Die Affinität hängt von mehreren Faktoren ab, darunter:

  • das spezifische Antikörper-Antigen-Paar

  • Umweltbedingungen wie pH-Wert, ionische Stärke und Temperatur

Sie wird üblicherweise durch die Affinitätskonstante charakterisiert, die die Stabilität des Antigen-Antikörper-Komplexes beschreibt.

Antigenvalenz

Die Valenz eines Antigens entspricht der Anzahl der antigenen Determinanten (Epitope), die auf einem Antigen vorhanden sind. Diese Epitope können identisch oder strukturell verschieden sein.

Ein multivalentes Antigen kann gleichzeitig mit mehreren Antikörpern interagieren.

Antikörperavidität

Die Avidität beschreibt die Gesamtbindungsstärke zwischen einem multivalenten Antikörper und einem multivalenten Antigen.

Sie stellt den kumulativen Effekt mehrerer gleichzeitig stattfindender Affinitätsinteraktionen dar. Bei polykolonalen Antikörpern ist die Avidität häufig hoch, da mehrere Antikörper unterschiedliche Epitope desselben Antigens erkennen.

Qualität von Antikörpern: Spezifität und Bindungsstärke

Die Qualität eines Antikörpers hängt hauptsächlich von zwei Eigenschaften ab.

Spezifität

Die Spezifität beschreibt die Fähigkeit eines Antikörpers, nur das Zielantigen zu erkennen.

Eine hohe Spezifität ist entscheidend, um Kreuzreaktionen zu vermeiden, bei denen Antikörper an andere Proteine oder Verunreinigungen binden.

Bindungsstärke

Ein Antikörper muss außerdem stark mit seinem Zielantigen interagieren. Diese Eigenschaft hängt sowohl von Affinität als auch von Avidität ab.

Eine hohe Bindungsstärke verbessert die Empfindlichkeit immunologischer Nachweismethoden.

Immunogene für die Antikörperproduktion

Das Molekül, das zur Auslösung einer Immunreaktion verwendet wird, wird Immunogen genannt.

Häufig verwendete Immunogene sind:

  • Proteine

  • synthetische Peptide

Andere Moleküle wie Polysaccharide, Nukleinsäuren oder kleine organische Moleküle (Haptene < 3 kDa) sind allein meist nicht immunogen. Diese müssen mit Trägerproteinen hoher Molekülmasse gekoppelt werden.

Typische Trägerproteine sind beispielsweise:

  • Rinderserumalbumin (BSA)

  • Thyreoglobulin

Optische Isomere eines Moleküls können aufgrund ihrer strukturellen Unterschiede verschiedene Antikörperpopulationen erzeugen.

In einigen Fällen können auch ganze Zellen, Gewebeextrakte oder Zellfraktionen als Immunogene verwendet werden.

Vorbereitung des Immunogens

Die Vorbereitung des Immunogens ist ein entscheidender Schritt bei der Antikörperproduktion.

Das Antigen muss:

  • steril sein

  • frei von Toxinen

  • frei von Pyrogenen

  • frei von Proteinverunreinigungen

Kontaminierte Antigenpräparate können zur Bildung von Antikörpern gegen Verunreinigungen führen, anstatt gegen das gewünschte Zielantigen. Dies reduziert die Effizienz der Immunisierung sowie die Spezifität des erzeugten Antiserums.

Darüber hinaus muss auch der strukturelle Zustand des Antigens berücksichtigt werden. Antikörper, die gegen ein denaturiertes Protein erzeugt wurden, erkennen möglicherweise nicht das native Protein.

Immunisierungsprotokoll

Bei der Planung eines Immunisierungsprotokolls müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden:

  • Auswahl der Tierart

  • Natur und Qualität des Immunogens

  • Auswahl des Adjuvans

  • Applikationsweg

  • Anzahl der Injektionsstellen

  • Antigendosis

  • Injektionsplan

Diese Faktoren beeinflussen direkt die Stärke und Spezifität der Immunantwort.

Auswahl der Versuchstiere

Die Produktion polykolonaler Antikörper erfolgt häufig in Neuseeland-Kaninchen.

Für jedes Antigen werden üblicherweise zwei Kaninchen immunisiert, da die Immunantwort zwischen einzelnen Tieren variieren kann.

Andere Tierarten können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise:

  • Maus

  • Ratte

  • Meerschweinchen

  • Ziege

  • Schaf

Größere Tiere werden verwendet, wenn größere Mengen an Immunsérum benötigt werden.

Rolle der Adjuvantien

Die Antigenpräparation wird normalerweise mit einem Adjuvans gemischt, das die Immunantwort verstärkt.

Adjuvantien erhöhen:

  • die Immunogenität des Antigens

  • die Langzeitfreisetzung des Antigens

  • den Schutz des Antigens vor schneller Degradation

  • die Präsentation des Antigens an das Immunsystem

  • eine anhaltende Immunstimulation

Freund-Adjuvans

Ein häufig verwendetes Adjuvans ist das Freund-Adjuvans.

Es besteht aus einer Emulsion aus Mineralöl, Wasser und einem Emulgator.

Es gibt zwei Formen:

Komplettes Freund-Adjuvans (CFA)
enthält inaktivierte Mycobacterium tuberculosis und stimuliert sowohl die humorale als auch die zelluläre Immunantwort.

Unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA)
enthält keine bakteriellen Bestandteile und wird häufig für Booster-Injektionen verwendet.

Standard-Immunisierungsprotokolle

Je nach Immunogenität des Antigens und verfügbarer Zeit werden verschiedene Protokolle verwendet.

Kurzes Protokoll (53 Tage)

  • 3 Injektionen

  • 1 Testblutentnahme

Mittleres Protokoll (67 Tage)

  • 4 Injektionen

  • 2 Testblutentnahmen

Langes Protokoll (88 Tage)

  • 4 Injektionen

  • 2 Testblutentnahmen

Während der Immunisierung werden regelmäßig Blutproben entnommen, um den Antikörpertiter zu bestimmen.

Wenn der Titer ausreichend hoch ist, wird eine Endblutentnahme durchgeführt, um das Immunsérum zu gewinnen.

Herstellung von Antiserum

Nach der Blutentnahme wird das Serum mit den polykolonalen Antikörpern durch mehrere Schritte vorbereitet:

  1. Blut wird in einem sterilen Behälter gesammelt.

  2. Das Blut wird etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Gerinnung zu ermöglichen.

  3. Das Gerinnsel wird vorsichtig von den Gefäßwänden gelöst.

  4. Die Probe wird über Nacht bei 4°C gelagert.

  5. Das Serum wird durch sterile Gaze filtriert.

  6. Die Probe wird 15 Minuten bei 15000 rpm zentrifugiert.

  7. Der Überstand, der die polykolonalen Antikörper enthält, wird gesammelt.

Dieses Serum wird als Immunsérum oder Antiserum bezeichnet.

Eigenschaften polykolonaler Antiseren

Polykolonales Immunsérum enthält:

  • Antikörper verschiedener Immunglobulinklassen und Subklassen

  • Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten

  • Antikörper gegen mehrere antigene Determinanten

Diese Vielfalt ermöglicht eine starke und zuverlässige Antigenerkennung.

Anwendungen polykolonaler Antikörper

Polykolonale Antikörper werden häufig in der biomedizinischen Forschung und Diagnostik eingesetzt.

Wichtige Anwendungen sind:

  • ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

  • Western Blot

  • Immunhistochemie

  • Immunpräzipitation

Durch ihre Fähigkeit, mehrere Epitope zu erkennen, bieten sie häufig eine hohe Sensitivität bei der Antigendetektion, insbesondere bei niedrigen Antigenkonzentrationen.