Genius 2X SYBR Green Schnelle qPCR

Abstrakt
Viele Viren wurden mit dem Runting and Stunting Syndrome (RSS) in Verbindung gebracht. Diese Virusinfektionen betreffen hauptsächlich junge Hühner und verursachen Apathie, Depressionen, zerzauste Federn, Klumpenbildung und Durchfall. Hühner-Parvovirus (ChPV) ist eine solche Infektion und wurde weltweit bei Hühnern nachgewiesen, die Anzeichen von Darmerkrankungen zeigten. Daher zielt die vorliegende Studie darauf ab, einen sensitiven Echtzeit-Schnell-qPCR-Assay auf Basis von SYBR Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV zu entwickeln.

Ein 561-bp-nichtstrukturelles (NS)-Gen wurde amplifiziert und kloniert, und ein Primerpaar wurde basierend auf konservierten Nukleotidsequenzen auf dem NS-Gen von ChPV entworfen, das interkalierende DNA-Reagenz SYBR Green wurde verwendet und der Fast-Modus von Es wurde ein Thermocycler verwendet. Der Assay weist 109 bis 101 Kopien des Genoms (CG) nach. Die Nachweisgrenze (LoD) wurde auf fünf CG und die Bestimmungsgrenze (LoQ) auf zehn CG geschätzt. Die Effizienz der Standardkurve betrug 101,94 %, und die Schmelzkurve zeigte einen einzigartigen sauberen Peak und eine Schmelztemperatur von 79,3 °C. Der Assay war spezifisch für die Amplifikation des ChPV-NS-Gens, und es wurde keine Amplifikation von anderen viralen Genomen oder in den Negativkontrollen gezeigt. Insgesamt wurden 141 Proben mit dem Assay getestet, von denen 139 Proben positiv befunden wurden. Der höchste CG-Wert von ChPV betrug 5,7 × 10 6 CG/μL DNA ohne offensichtliche klinische Anzeichen einer enterischen Störung, und 4,6 × 10 6 CG/μL DNA wurden bei Hühnern mit RSS nachgewiesen.

Einführung

Das Runting-Stunting-Syndrom (RSS) ist ein Erreger, der junge, eine Woche alte Küken befällt und eine schlechte Futterverwertung, Wachstumsverzögerung, Zwergwuchs, Keulung und Sterblichkeit verursacht [1,2,3].

  • Im Allgemeinen zeigen die Küken Depressionen, Apathie, zerzauste Federn, Kloakenverklebungen und die charakteristischsten Anzeichen, Durchfall und Unsicherheit [3,4].
  • Die ätiologischen Erreger im Zusammenhang mit RSS bleiben unbekannt; Es wurden jedoch viele Viren entdeckt und als Erreger der Krankheit in Verbindung gebracht, darunter Astroviren, Coronaviren, Rotaviren, Reovirus, Parvovirus und andere [5,6,7,8,9,10].
  • Parvovirus ist ein viraler Erreger, der viele Tiere befällt, darunter Säugetiere wie Kühe, Hunde, Katzen, Ratten und Fledermäuse [11]. Viele experimentelle Infektionen wurden mit isolierten enterischen Viren wie Astrovirus, Vogelnephritisvirus (ANV), Rotavirus und Chicken Parvovirus (ChVP) durchgeführt, um die Pathogenese von RSS aufzuklären [6,12,13].
  • Diese Studien haben ergeben, dass ChPV ein ätiologisches Agens im Zusammenhang mit RSS sein könnte und als Hauptverursacher dieser Darmerkrankung angesehen werden könnte [3,14].
  • Zusätzlich verursacht ChPV bei Barbarie-Enten die Derzsy-Krankheit [15].
  • Bei Hühnern war es mit einer Krümmung der Zwölffingerdarmschlinge, Pankreasatrophie und Mesenteritis verbunden [16], und es wurde bei Hühnern und Puten mit Anzeichen von Darmerkrankungen und bei scheinbar gesunden Tieren nachgewiesen [17,18,19].

ChPV ist ein unbehülltes, doppelsträngiges DNA-Virus mit positivem Sinn, von dem erstmals berichtet wurde, dass es Darmstörungen bei 10 Tage alten Küken verursacht [4].

Danach wurden viele andere Studien durchgeführt, um die Rolle von ChPV bei enterischen Erkrankungen, Durchfall und anderen enterischen Manifestationen aufzuklären [3,13]. Das vollständig zusammengesetzte ChPV-Genom hat eine Länge von 5275 bp und ist im nichtstrukturellen (NS) Gen organisiert, das ein nichtstrukturelles Protein kodiert und ORF1 und ORF2 enthält, die Proteine, die an der viralen Replikation beteiligt sind; die VP1- und VP2-Gene, die die Strukturproteine ​​codieren, aus denen das virale Kapsid besteht, und das NP1-Gen, das ORF3 enthält, das sich zwischen ORF1 und ORF2 befindet [20]. Basierend auf den Sequenzen dieser Gene wurden ein PCR-Endpunkt und Echtzeit-PCR (qPCR)-Assays zur Identifizierung von ChPV entwickelt [21]. Die Mehrzahl dieser Assays konzentrierte sich auf das NS-Gen [8,22,23], da es das am stärksten konservierte Gen in ChPV ist. Der erste entwickelte PCR-Assay wurde von Zsak et al. [8], wo die Primer eine konservierte Region des NS-Gens flankierten, und derzeit wurden zwei qPCR-Assays basierend auf derselben NS-Region entwickelt [22]. Ein weiterer qPCR-Assay wurde entwickelt, um einen Teil der VP2-Genregion zu amplifizieren [21]. Alle diese Assays zeigten eine hohe Sensitivität für den Nachweis und die Quantifizierung von ChPV. In den brasilianischen Hühnerherden wurden in den letzten Jahren viele RSS-Ausbrüche gemeldet, bei denen ChPV nachgewiesen und das NS-Gen sequenziert wurde, was bestätigte, dass die Sequenzen zu ChPV gehörten, wodurch das Virus bereits bei jungen und alten Hühnern identifiziert wurde erster Tag der Infektion [9,16,24,25,26]. Enterische Erkrankungen verursachen wirtschaftliche Verluste bei Geflügel, den Wertverlust von Geflügelbeständen und eine erhöhte Anfälligkeit für andere Krankheiten, daher sollte ein schneller, wirksamer, erschwinglicher und zuverlässiger Assay für die Diagnose des ätiologischen Erregers standardisiert werden [27,28,29].

Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix

RK21204 Abclonal 1 mL Ask for price

Genious 2X SYBR GREEN FAST qPCR MIX (No ROX)

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2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix

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Genious 2X SYBRGREEN FASTqPCR MIX (High ROX)

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2x SYBR Green qPCR Master Mix

B21202 Bimake 5 mL 268.8 EUR

2x SYBR Green qPCR Master Mix

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HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix

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HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix

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HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix

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SYBR Green qPCR Master Mix

HY-K0501 MedChemExpress 5 mL (500 rxns) 315.6 EUR

HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix

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HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix

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Ultra SYBR Green qPCR Master Mix (2X, with ROX I)

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SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX)

HY-K0523 MedChemExpress 5 mL (500 rxns ) 308.4 EUR

SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)

HY-K0522 MedChemExpress 5 mL (500 rxns ) 308.4 EUR

AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix

Q111-02 Vazyme 500 rxn (20 μl/rxn) 265.2 EUR

AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix

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SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

HY-K0521 MedChemExpress 1 mL (100 rxns) 135.6 EUR

BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG

RK21219 Abclonal 5mL 475 EUR

Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green

FYT103-100P Yeastern Biotech 100 Preps 1.25 ml Ask for price

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SYBR Green I

B1747-25 Biovision each 1396.8 EUR

SYBR Green I

B1747-5 Biovision each 464.4 EUR

LncRNA Profiler Complete qPCR Array Kit (cDNA synthesis kit, qPCR array and SYBR Green reagent) 20 profiles

RA910A-1 SBI 20 profiles 1329.6 EUR

TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX*

17276-1mL AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX*

17277-5mL AAT Bioquest 5 mL 308 EUR

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TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX*

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TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX*

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20×SYBR Green Dye

EQ021 ELK Biotech 1ml 55 EUR

ABScript II One Step SYBR Green RT-qPCR Kit

RK20404 Abclonal 10 RXN Ask for price

EZSolution? SYBR Green I

B1748-1 Biovision each 744 EUR

EZSolution? SYBR Green I

B1748-500 Biovision each 516 EUR

TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX*

17276 AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX*

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TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX*

17278 AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX*

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TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX*

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TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX*

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SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well*

67008 AAT Bioquest 1 Plate 97 EUR

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67008-1Plate AAT Bioquest 1 Plate 97 EUR

qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-372L MiTeGen 10 x 1,25 ml 818 EUR

qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-372S MiTeGen 2 x 1,25 ml 205 EUR

qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-373L MiTeGen 10 x 1,25 ml 818 EUR

qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-373S MiTeGen 2 x 1,25 ml 205 EUR

qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-375L MiTeGen 10 x 1,25 ml 982 EUR

qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-375S MiTeGen 2 x 1,25 ml 246 EUR

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix

EQ001 ELK Biotech 5mL 340 EUR

qPCR SybrMaster highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-374L MiTeGen 10 x 1,25 ml 818 EUR

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M-PCR-374S MiTeGen 2 x 1,25 ml 205 EUR

One Step SYBR Green RT-PCR Mix

EQ007 ELK Biotech 20 µL x 100 rxn 248 EUR

qPCR SybrMaster UNG lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-376L MiTeGen 10 x 1,25 ml 982 EUR

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M-PCR-376S MiTeGen 2 x 1,25 ml 246 EUR

qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-377L MiTeGen 10 x 1,25 ml 982 EUR

qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service

M-PCR-377S MiTeGen 2 x 1,25 ml 246 EUR

SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain

HY-K1004 MedChemExpress 100 μL 135.6 EUR

Green qPCR SuperMix

20-abx098031 Abbexa
  • 1245.60 EUR
  • 526.80 EUR
  • 760.80 EUR
  • 15 ml
  • 1 ml
  • 5 ml

Fast Green FCF

abx082188-5g Abbexa 5 g 243.6 EUR

Fast Green FCF

FB0452 Bio Basic 5g 66.26 EUR

Fast Green FCF

HY-D0914 MedChemExpress 500mg 129.6 EUR

Fast Green FCF

21770016-1 Bio-WORLD 50 g 36.33 EUR

Fast Green FCF

21770016-2 Bio-WORLD 100 g 63.98 EUR

Fast Green FCF

21770016-3 Bio-WORLD 8 oz 128.11 EUR

Fast Green Solution

FGN125 ScyTek Laboratories 125 ml 79.2 EUR

Fast Green Solution

FGN500 ScyTek Laboratories 500 ml 115.2 EUR

Fast Green Solution

FGN999 ScyTek Laboratories 1000 ml 148.8 EUR

2×SYBR-Green-qPCR-Mix

E37F021 EnoGene 10×5mL 1360 EUR

Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 2500 reactions (1x25ml, 2x1.25ml)

PR2120-N-25BLK Benchmark Scientific 1 each 2695 EUR

Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 5000 reactions (1x50ml, 4x1.25ml)

PR2120-N-50BLK Benchmark Scientific 1 each 4785 EUR

ChamQ SYBR qPCR Master Mix

Q311-02 Vazyme 500 rxns (20 μl/rxn) 96.44 EUR

ChamQ SYBR qPCR Master Mix

Q311-03 Vazyme 2,500 rxns (20 μl/rxn) 434.8 EUR

Green qPCR SuperMix UDG

20-abx098032 Abbexa
  • 1362.00 EUR
  • 543.60 EUR
  • 794.40 EUR
  • 15 ml
  • 1 ml
  • 5 ml

Top Green qPCR SuperMix

20-abx098033 Abbexa
  • 994.80 EUR
  • 260.40 EUR
  • 1362.00 EUR
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  • 15 ml
  • 1 ml
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  • 5 ml

Tip Green qPCR SuperMix

20-abx098034 Abbexa
  • 1161.60 EUR
  • 276.00 EUR
  • 1596.00 EUR
  • 560.40 EUR
  • 15 ml
  • 1 ml
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  • 5 ml

25G Fast Green FCF

NAT1348 Scientific Laboratory Supplies 25G 196.8 EUR

HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit

Q221-01 Vazyme 100 rxn (50 μl/rxn) 396 EUR

Accuris qMAX SYBR Green, No ROX, 2500 reactions (1x25ml)

PR2000-N-25BLK Benchmark Scientific 1 each 1133 EUR

Accuris qMAX SYBR Green, No ROX, 5000 reactions (1x50ml)

PR2000-N-50BLK Benchmark Scientific 1 each 2039.4 EUR

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix(Low ROX Premixed)

EQ014 ELK Biotech 5mL 340 EUR

EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix(High ROX Premixed)

EQ013 ELK Biotech 5mL 340 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-100G Glentham Life Sciences 100 g 274.8 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-10G Glentham Life Sciences 10 g 74.4 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-25G Glentham Life Sciences 25 g 112.8 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-5G Glentham Life Sciences 5 g 64.8 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-10 Glentham Life Sciences 10 31.7 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-100 Glentham Life Sciences 100 197.7 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-25 Glentham Life Sciences 25 63.3 EUR

Fast Green FCF (C.I. 42053)

GT3407-5 Glentham Life Sciences 5 23.8 EUR

Deoxy+ SYBR Green OneStep qRT-PCRKit wi ROX, 100 preps

FYT504-100P Yeastern Biotech 1 vial Ask for price

Deoxy+ SYBR Green OneStep qRT-PCRwi ROX Kit, 50 preps

FYT504-50P Yeastern Biotech 1 vial Ask for price

ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix

Q411-02 Vazyme 500 rxns (20 μl/rxn) 112.5 EUR

ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix

Q411-03 Vazyme 2,500 rxns (20 μl/rxn) 507.2 EUR

In der vorliegenden Studie berichten wir über die Entwicklung eines hochempfindlichen Echtzeit-Schnell-qPCR-Assays auf Basis von SYBR® Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV, der aufgrund seiner Kombination aus Zyklusschritten und schnelleren Temperaturänderungen schneller ist als andere aktuelle Assays , schnellere Enzyme und ist so empfindlich, dass sehr geringe Viruskonzentrationen im Darminhalt von Tieren mit oder ohne klinische Anzeichen einer Darmerkrankung nachgewiesen werden können.

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