Abstrakt
Viele Viren wurden mit dem Runting and Stunting Syndrome (RSS) in Verbindung gebracht. Diese Virusinfektionen betreffen hauptsächlich junge Hühner und verursachen Apathie, Depressionen, zerzauste Federn, Klumpenbildung und Durchfall. Hühner-Parvovirus (ChPV) ist eine solche Infektion und wurde weltweit bei Hühnern nachgewiesen, die Anzeichen von Darmerkrankungen zeigten. Daher zielt die vorliegende Studie darauf ab, einen sensitiven Echtzeit-Schnell-qPCR-Assay auf Basis von SYBR Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV zu entwickeln.
Ein 561-bp-nichtstrukturelles (NS)-Gen wurde amplifiziert und kloniert, und ein Primerpaar wurde basierend auf konservierten Nukleotidsequenzen auf dem NS-Gen von ChPV entworfen, das interkalierende DNA-Reagenz SYBR Green wurde verwendet und der Fast-Modus von Es wurde ein Thermocycler verwendet. Der Assay weist 109 bis 101 Kopien des Genoms (CG) nach. Die Nachweisgrenze (LoD) wurde auf fünf CG und die Bestimmungsgrenze (LoQ) auf zehn CG geschätzt. Die Effizienz der Standardkurve betrug 101,94 %, und die Schmelzkurve zeigte einen einzigartigen sauberen Peak und eine Schmelztemperatur von 79,3 °C. Der Assay war spezifisch für die Amplifikation des ChPV-NS-Gens, und es wurde keine Amplifikation von anderen viralen Genomen oder in den Negativkontrollen gezeigt. Insgesamt wurden 141 Proben mit dem Assay getestet, von denen 139 Proben positiv befunden wurden. Der höchste CG-Wert von ChPV betrug 5,7 × 10 6 CG/μL DNA ohne offensichtliche klinische Anzeichen einer enterischen Störung, und 4,6 × 10 6 CG/μL DNA wurden bei Hühnern mit RSS nachgewiesen.
Einführung
Das Runting-Stunting-Syndrom (RSS) ist ein Erreger, der junge, eine Woche alte Küken befällt und eine schlechte Futterverwertung, Wachstumsverzögerung, Zwergwuchs, Keulung und Sterblichkeit verursacht [1,2,3].
- Im Allgemeinen zeigen die Küken Depressionen, Apathie, zerzauste Federn, Kloakenverklebungen und die charakteristischsten Anzeichen, Durchfall und Unsicherheit [3,4].
- Die ätiologischen Erreger im Zusammenhang mit RSS bleiben unbekannt; Es wurden jedoch viele Viren entdeckt und als Erreger der Krankheit in Verbindung gebracht, darunter Astroviren, Coronaviren, Rotaviren, Reovirus, Parvovirus und andere [5,6,7,8,9,10].
- Parvovirus ist ein viraler Erreger, der viele Tiere befällt, darunter Säugetiere wie Kühe, Hunde, Katzen, Ratten und Fledermäuse [11]. Viele experimentelle Infektionen wurden mit isolierten enterischen Viren wie Astrovirus, Vogelnephritisvirus (ANV), Rotavirus und Chicken Parvovirus (ChVP) durchgeführt, um die Pathogenese von RSS aufzuklären [6,12,13].
- Diese Studien haben ergeben, dass ChPV ein ätiologisches Agens im Zusammenhang mit RSS sein könnte und als Hauptverursacher dieser Darmerkrankung angesehen werden könnte [3,14].
- Zusätzlich verursacht ChPV bei Barbarie-Enten die Derzsy-Krankheit [15].
- Bei Hühnern war es mit einer Krümmung der Zwölffingerdarmschlinge, Pankreasatrophie und Mesenteritis verbunden [16], und es wurde bei Hühnern und Puten mit Anzeichen von Darmerkrankungen und bei scheinbar gesunden Tieren nachgewiesen [17,18,19].
ChPV ist ein unbehülltes, doppelsträngiges DNA-Virus mit positivem Sinn, von dem erstmals berichtet wurde, dass es Darmstörungen bei 10 Tage alten Küken verursacht [4].
Danach wurden viele andere Studien durchgeführt, um die Rolle von ChPV bei enterischen Erkrankungen, Durchfall und anderen enterischen Manifestationen aufzuklären [3,13]. Das vollständig zusammengesetzte ChPV-Genom hat eine Länge von 5275 bp und ist im nichtstrukturellen (NS) Gen organisiert, das ein nichtstrukturelles Protein kodiert und ORF1 und ORF2 enthält, die Proteine, die an der viralen Replikation beteiligt sind; die VP1- und VP2-Gene, die die Strukturproteine codieren, aus denen das virale Kapsid besteht, und das NP1-Gen, das ORF3 enthält, das sich zwischen ORF1 und ORF2 befindet [20]. Basierend auf den Sequenzen dieser Gene wurden ein PCR-Endpunkt und Echtzeit-PCR (qPCR)-Assays zur Identifizierung von ChPV entwickelt [21]. Die Mehrzahl dieser Assays konzentrierte sich auf das NS-Gen [8,22,23], da es das am stärksten konservierte Gen in ChPV ist. Der erste entwickelte PCR-Assay wurde von Zsak et al. [8], wo die Primer eine konservierte Region des NS-Gens flankierten, und derzeit wurden zwei qPCR-Assays basierend auf derselben NS-Region entwickelt [22]. Ein weiterer qPCR-Assay wurde entwickelt, um einen Teil der VP2-Genregion zu amplifizieren [21]. Alle diese Assays zeigten eine hohe Sensitivität für den Nachweis und die Quantifizierung von ChPV. In den brasilianischen Hühnerherden wurden in den letzten Jahren viele RSS-Ausbrüche gemeldet, bei denen ChPV nachgewiesen und das NS-Gen sequenziert wurde, was bestätigte, dass die Sequenzen zu ChPV gehörten, wodurch das Virus bereits bei jungen und alten Hühnern identifiziert wurde erster Tag der Infektion [9,16,24,25,26]. Enterische Erkrankungen verursachen wirtschaftliche Verluste bei Geflügel, den Wertverlust von Geflügelbeständen und eine erhöhte Anfälligkeit für andere Krankheiten, daher sollte ein schneller, wirksamer, erschwinglicher und zuverlässiger Assay für die Diagnose des ätiologischen Erregers standardisiert werden [27,28,29].
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21204 | Abclonal | 1 mL | 328.5 EUR |
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix (No ROX) |
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RK21205 | Abclonal | 1 ml | 328.5 EUR |
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix (Low ROX Premixed) |
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RK21206 | Abclonal | 1 ml | 328.5 EUR |
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix (High ROX Premixed) |
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RK21207 | Abclonal | 1 ml | 93 EUR |
2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21203 | Abclonal | 1 mL | 76.5 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21202 | Bimake | 5 mL | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21203 | Bimake | 25 mL | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21702 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21703 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21402 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21403 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-25 | ApexBio | 25ml | 336 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-5 | ApexBio | 5ml | 96 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-50 | ApexBio | 50ml | 672 EUR |
ig SYBR Green qPCR 2X Master Mix - 200 Reactions |
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3354 | Intact Genomics | 200 | 110 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-25 | ApexBio | 25ml | 336 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-5 | ApexBio | 5ml | 96 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-50 | ApexBio | 50ml | 672 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix |
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HY-K0501 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns) | 315.6 EUR |
Ultra SYBR Green qPCR Master Mix (2X, with ROX I) |
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W2601-1 | 101Bio | 1 mL | 149 EUR |
Ultra SYBR Green qPCR Master Mix (2X, with ROX I) |
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W2601-5 | 101Bio | 500 rxn, 5 mL | 349 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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C0006-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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C0006-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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C0006-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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C0006-50mg | TargetMol Chemicals | 50mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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C0006-5mg | TargetMol Chemicals | 5mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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HY-K0523 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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C0008-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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C0008-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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C0008-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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C0008-50mg | TargetMol Chemicals | 50mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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C0008-5mg | TargetMol Chemicals | 5mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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HY-K0522 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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C0007-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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C0007-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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C0007-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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C0007-50mg | TargetMol Chemicals | 50mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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C0007-5mg | TargetMol Chemicals | 5mg | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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HY-K0521 | MedChemExpress | 1 mL (100 rxns) | 135.6 EUR |
BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG |
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RK21219 | Abclonal | 5mL | 475 EUR |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps 1.25 ml | Ask for price |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-400P | Yeastern Biotech | 400 Preps 1.25 ml x 4 | Ask for price |
LncRNA Profiler Complete qPCR Array Kit (cDNA synthesis kit, qPCR array and SYBR Green reagent) 20 profiles |
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RA910A-1 | SBI | 20 profiles | 1329.6 EUR |
TM 2x Sybr qPCR Super Mix |
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TBS4001R-2.5 | Tribioscience | 2.5 ml | 129 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17276 | AAT Bioquest | 1 mL | 203 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17276-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17277 | AAT Bioquest | 5 mL | 508 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17277-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17278 | AAT Bioquest | 1 mL | 203 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17278-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17279 | AAT Bioquest | 5 mL | 508 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17279-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
SYBR Green I |
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B1747-25 | Biovision | each | 1396.8 EUR |
SYBR Green I |
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B1747-5 | Biovision | each | 464.4 EUR |
SYBR GREEN 1 |
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TD0001-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
SYBR GREEN 1 |
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TD0001-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
SYBR GREEN 1 |
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TD0001-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
SYBR GREEN 1 |
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TD0001-50mg | TargetMol Chemicals | 50mg | Ask for price |
SYBR GREEN 1 |
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TD0001-5mg | TargetMol Chemicals | 5mg | Ask for price |
SYBR GREEN II |
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TD0005-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
SYBR GREEN II |
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TD0005-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
SYBR GREEN II |
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TD0005-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
SYBR GREEN II |
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TD0005-50mg | TargetMol Chemicals | 50mg | Ask for price |
SYBR GREEN II |
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TD0005-5mg | TargetMol Chemicals | 5mg | Ask for price |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17280 | AAT Bioquest | 1 mL | 203 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17280-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17281 | AAT Bioquest | 5 mL | 508 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17281-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
ABScript II One Step SYBR Green RT-qPCR Kit |
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RK20404 | Abclonal | 10 RXN | 120 EUR |
20×SYBR Green Dye |
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EQ021 | ELK Biotech | 1ml | 55 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-1 | Biovision | each | 744 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-500 | Biovision | each | 516 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-372L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-372S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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67008 | AAT Bioquest | 1 Plate | 99 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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67008-1Plate | AAT Bioquest | 1 Plate | 97 EUR |
ViPrimePLUSHigh 5X One Step RT-qPCR Green Master Mix I (SYBR® Green Dye), 100rxns |
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QLMM10 | Vivantis | each | Ask for price |
qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-373L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-373S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-375L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-375S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
qPCR SybrMaster highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-374L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMaster highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-374S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
qPCR SybrMaster UNG lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-376L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNG lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-376S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-377L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-377S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix |
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EQ001 | ELK Biotech | 5mL | 340 EUR |
SYBR® Green Fluorescent DNA Stain |
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PCR-378 | Jena Bioscience GmbH | 500µl | 58.1 EUR |
SYBR® Green Fluorescent DNA Stain |
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PCR-378-100ML | Jena Bioscience GmbH | 100ml | 2630 EUR |
SYBR® Green Fluorescent DNA Stain |
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PCR-378-10ML | Jena Bioscience GmbH | 10ml | 526 EUR |
SYBR® Green Fluorescent DNA Stain |
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PCR-378-1ML | Jena Bioscience GmbH | 1ml | 105.2 EUR |
One Step SYBR Green RT-PCR Mix |
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EQ007 | ELK Biotech | 20 µL x 100 rxn | 248 EUR |
Green qPCR SuperMix |
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20-abx098031 | Abbexa |
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Green qPCR SuperMix |
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abx098031-100l | Abbexa | 100 µl | 675 EUR |
Green qPCR SuperMix |
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abx098031-200l | Abbexa | 200 µl | 912.5 EUR |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain |
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HY-K1004 | MedChemExpress | 100 μL | 135.6 EUR |
Fast Green FCF |
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15939-54 | NACALAI TESQUE | 10G | 74.48 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-1 | Glycomatrix | 50 g | 36.33 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-2 | Glycomatrix | 100 g | 63.98 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-3 | Glycomatrix | 8 oz | 128.11 EUR |
Fast Green FCF |
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FB0452 | Bio Basic | 5g | 66.26 EUR |
Fast Green FCF |
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596130 | MedKoo Biosciences | 5.0g | 350 EUR |
Fast Green FCF |
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abx082188-5g | Abbexa | 5 g | 243.6 EUR |
Fast Green FCF |
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T7772-10mg | TargetMol Chemicals | 10mg | Ask for price |
Fast Green FCF |
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T7772-1g | TargetMol Chemicals | 1g | Ask for price |
Fast Green FCF |
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T7772-1mg | TargetMol Chemicals | 1mg | Ask for price |
In der vorliegenden Studie berichten wir über die Entwicklung eines hochempfindlichen Echtzeit-Schnell-qPCR-Assays auf Basis von SYBR® Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV, der aufgrund seiner Kombination aus Zyklusschritten und schnelleren Temperaturänderungen schneller ist als andere aktuelle Assays , schnellere Enzyme und ist so empfindlich, dass sehr geringe Viruskonzentrationen im Darminhalt von Tieren mit oder ohne klinische Anzeichen einer Darmerkrankung nachgewiesen werden können.