Abstrakt
Viele Viren wurden mit dem Runting and Stunting Syndrome (RSS) in Verbindung gebracht. Diese Virusinfektionen betreffen hauptsächlich junge Hühner und verursachen Apathie, Depressionen, zerzauste Federn, Klumpenbildung und Durchfall. Hühner-Parvovirus (ChPV) ist eine solche Infektion und wurde weltweit bei Hühnern nachgewiesen, die Anzeichen von Darmerkrankungen zeigten. Daher zielt die vorliegende Studie darauf ab, einen sensitiven Echtzeit-Schnell-qPCR-Assay auf Basis von SYBR Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV zu entwickeln.
Ein 561-bp-nichtstrukturelles (NS)-Gen wurde amplifiziert und kloniert, und ein Primerpaar wurde basierend auf konservierten Nukleotidsequenzen auf dem NS-Gen von ChPV entworfen, das interkalierende DNA-Reagenz SYBR Green wurde verwendet und der Fast-Modus von Es wurde ein Thermocycler verwendet. Der Assay weist 109 bis 101 Kopien des Genoms (CG) nach. Die Nachweisgrenze (LoD) wurde auf fünf CG und die Bestimmungsgrenze (LoQ) auf zehn CG geschätzt. Die Effizienz der Standardkurve betrug 101,94 %, und die Schmelzkurve zeigte einen einzigartigen sauberen Peak und eine Schmelztemperatur von 79,3 °C. Der Assay war spezifisch für die Amplifikation des ChPV-NS-Gens, und es wurde keine Amplifikation von anderen viralen Genomen oder in den Negativkontrollen gezeigt. Insgesamt wurden 141 Proben mit dem Assay getestet, von denen 139 Proben positiv befunden wurden. Der höchste CG-Wert von ChPV betrug 5,7 × 10 6 CG/μL DNA ohne offensichtliche klinische Anzeichen einer enterischen Störung, und 4,6 × 10 6 CG/μL DNA wurden bei Hühnern mit RSS nachgewiesen.
Einführung
Das Runting-Stunting-Syndrom (RSS) ist ein Erreger, der junge, eine Woche alte Küken befällt und eine schlechte Futterverwertung, Wachstumsverzögerung, Zwergwuchs, Keulung und Sterblichkeit verursacht [1,2,3].
- Im Allgemeinen zeigen die Küken Depressionen, Apathie, zerzauste Federn, Kloakenverklebungen und die charakteristischsten Anzeichen, Durchfall und Unsicherheit [3,4].
- Die ätiologischen Erreger im Zusammenhang mit RSS bleiben unbekannt; Es wurden jedoch viele Viren entdeckt und als Erreger der Krankheit in Verbindung gebracht, darunter Astroviren, Coronaviren, Rotaviren, Reovirus, Parvovirus und andere [5,6,7,8,9,10].
- Parvovirus ist ein viraler Erreger, der viele Tiere befällt, darunter Säugetiere wie Kühe, Hunde, Katzen, Ratten und Fledermäuse [11]. Viele experimentelle Infektionen wurden mit isolierten enterischen Viren wie Astrovirus, Vogelnephritisvirus (ANV), Rotavirus und Chicken Parvovirus (ChVP) durchgeführt, um die Pathogenese von RSS aufzuklären [6,12,13].
- Diese Studien haben ergeben, dass ChPV ein ätiologisches Agens im Zusammenhang mit RSS sein könnte und als Hauptverursacher dieser Darmerkrankung angesehen werden könnte [3,14].
- Zusätzlich verursacht ChPV bei Barbarie-Enten die Derzsy-Krankheit [15].
- Bei Hühnern war es mit einer Krümmung der Zwölffingerdarmschlinge, Pankreasatrophie und Mesenteritis verbunden [16], und es wurde bei Hühnern und Puten mit Anzeichen von Darmerkrankungen und bei scheinbar gesunden Tieren nachgewiesen [17,18,19].
ChPV ist ein unbehülltes, doppelsträngiges DNA-Virus mit positivem Sinn, von dem erstmals berichtet wurde, dass es Darmstörungen bei 10 Tage alten Küken verursacht [4].
Danach wurden viele andere Studien durchgeführt, um die Rolle von ChPV bei enterischen Erkrankungen, Durchfall und anderen enterischen Manifestationen aufzuklären [3,13]. Das vollständig zusammengesetzte ChPV-Genom hat eine Länge von 5275 bp und ist im nichtstrukturellen (NS) Gen organisiert, das ein nichtstrukturelles Protein kodiert und ORF1 und ORF2 enthält, die Proteine, die an der viralen Replikation beteiligt sind; die VP1- und VP2-Gene, die die Strukturproteine codieren, aus denen das virale Kapsid besteht, und das NP1-Gen, das ORF3 enthält, das sich zwischen ORF1 und ORF2 befindet [20]. Basierend auf den Sequenzen dieser Gene wurden ein PCR-Endpunkt und Echtzeit-PCR (qPCR)-Assays zur Identifizierung von ChPV entwickelt [21]. Die Mehrzahl dieser Assays konzentrierte sich auf das NS-Gen [8,22,23], da es das am stärksten konservierte Gen in ChPV ist. Der erste entwickelte PCR-Assay wurde von Zsak et al. [8], wo die Primer eine konservierte Region des NS-Gens flankierten, und derzeit wurden zwei qPCR-Assays basierend auf derselben NS-Region entwickelt [22]. Ein weiterer qPCR-Assay wurde entwickelt, um einen Teil der VP2-Genregion zu amplifizieren [21]. Alle diese Assays zeigten eine hohe Sensitivität für den Nachweis und die Quantifizierung von ChPV. In den brasilianischen Hühnerherden wurden in den letzten Jahren viele RSS-Ausbrüche gemeldet, bei denen ChPV nachgewiesen und das NS-Gen sequenziert wurde, was bestätigte, dass die Sequenzen zu ChPV gehörten, wodurch das Virus bereits bei jungen und alten Hühnern identifiziert wurde erster Tag der Infektion [9,16,24,25,26]. Enterische Erkrankungen verursachen wirtschaftliche Verluste bei Geflügel, den Wertverlust von Geflügelbeständen und eine erhöhte Anfälligkeit für andere Krankheiten, daher sollte ein schneller, wirksamer, erschwinglicher und zuverlässiger Assay für die Diagnose des ätiologischen Erregers standardisiert werden [27,28,29].
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21204 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
Genious 2X SYBR GREEN FAST qPCR MIX (No ROX) |
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RK21205 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
Genious 2X SYBRGREEN FAST qPCR MIX (Low ROX) |
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RK21206 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21203 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
Genious 2X SYBRGREEN FASTqPCR MIX (High ROX) |
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RK21207 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21202 | Bimake | 5 mL | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21203 | Bimake | 25 mL | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21702 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21703 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21402 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21403 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-25 | ApexBio | 25ml | 420 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-5 | ApexBio | 5ml | 120 EUR |
HotStart™ 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1070-50 | ApexBio | 50ml | 840 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix |
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HY-K0501 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns) | 315.6 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-25 | ApexBio | 25ml | 420 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-5 | ApexBio | 5ml | 120 EUR |
HotStart™ Universal 2X SYBR Green qPCR Master Mix |
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K1170-50 | ApexBio | 50ml | 840 EUR |
Ultra SYBR Green qPCR Master Mix (2X, with ROX I) |
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W2601-1 | 101Bio | - | Ask for price |
Ultra SYBR Green qPCR Master Mix (2X, with ROX I) |
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W2601-5 | 101Bio | - | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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HY-K0523 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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HY-K0522 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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HY-K0521 | MedChemExpress | 1 mL (100 rxns) | 135.6 EUR |
BrightCycle Universal SYBR Green qPCR Mix with UDG |
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RK21219 | Abclonal | 5mL | 475 EUR |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps 1.25 ml | Ask for price |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-400P | Yeastern Biotech | 400 Preps 1.25 ml x 4 | Ask for price |
SYBR Green I |
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B1747-25 | Biovision | each | 1396.8 EUR |
SYBR Green I |
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B1747-5 | Biovision | each | 464.4 EUR |
LncRNA Profiler Complete qPCR Array Kit (cDNA synthesis kit, qPCR array and SYBR Green reagent) 20 profiles |
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RA910A-1 | SBI | 20 profiles | 1329.6 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17276-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *No ROX* |
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17277-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17278-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *Low ROX* |
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17279-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17280-1mL | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuestâ„¢ FAST qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX* |
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17281-5mL | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
20×SYBR Green Dye |
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EQ021 | ELK Biotech | 1ml | 55 EUR |
ABScript II One Step SYBR Green RT-qPCR Kit |
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RK20404 | Abclonal | 10 RXN | Ask for price |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-1 | Biovision | each | 744 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-500 | Biovision | each | 516 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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17276 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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17277 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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17278 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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17279 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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17280 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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17281 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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67008 | AAT Bioquest | 1 Plate | 97 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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67008-1Plate | AAT Bioquest | 1 Plate | 97 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-372L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-372S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-373L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMaster lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-373S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-375L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNGMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-375S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix |
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EQ001 | ELK Biotech | 5mL | 340 EUR |
qPCR SybrMaster highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-374L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 818 EUR |
qPCR SybrMaster highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-374S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 205 EUR |
One Step SYBR Green RT-PCR Mix |
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EQ007 | ELK Biotech | 20 µL x 100 rxn | 248 EUR |
qPCR SybrMaster UNG lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-376L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNG lowROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-376S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-377L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 982 EUR |
qPCR SybrMaster UNG highROXMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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M-PCR-377S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 246 EUR |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain |
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HY-K1004 | MedChemExpress | 100 μL | 135.6 EUR |
Green qPCR SuperMix |
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20-abx098031 | Abbexa |
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Fast Green FCF |
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abx082188-5g | Abbexa | 5 g | 243.6 EUR |
Fast Green FCF |
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FB0452 | Bio Basic | 5g | 66.26 EUR |
Fast Green FCF |
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HY-D0914 | MedChemExpress | 500mg | 129.6 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-1 | Bio-WORLD | 50 g | 36.33 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-2 | Bio-WORLD | 100 g | 63.98 EUR |
Fast Green FCF |
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21770016-3 | Bio-WORLD | 8 oz | 128.11 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 79.2 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 115.2 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 148.8 EUR |
2×SYBR-Green-qPCR-Mix |
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E37F021 | EnoGene | 10×5mL | 1360 EUR |
Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 2500 reactions (1x25ml, 2x1.25ml) |
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PR2120-N-25BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 2695 EUR |
Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 5000 reactions (1x50ml, 4x1.25ml) |
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PR2120-N-50BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 4785 EUR |
ChamQ SYBR qPCR Master Mix |
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Q311-02 | Vazyme | 500 rxns (20 μl/rxn) | 96.44 EUR |
ChamQ SYBR qPCR Master Mix |
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Q311-03 | Vazyme | 2,500 rxns (20 μl/rxn) | 434.8 EUR |
Green qPCR SuperMix UDG |
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20-abx098032 | Abbexa |
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Top Green qPCR SuperMix |
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20-abx098033 | Abbexa |
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Tip Green qPCR SuperMix |
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20-abx098034 | Abbexa |
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25G Fast Green FCF |
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NAT1348 | Scientific Laboratory Supplies | 25G | 196.8 EUR |
HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit |
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Q221-01 | Vazyme | 100 rxn (50 μl/rxn) | 396 EUR |
Accuris qMAX SYBR Green, No ROX, 2500 reactions (1x25ml) |
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PR2000-N-25BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 1133 EUR |
Accuris qMAX SYBR Green, No ROX, 5000 reactions (1x50ml) |
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PR2000-N-50BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 2039.4 EUR |
EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix(Low ROX Premixed) |
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EQ014 | ELK Biotech | 5mL | 340 EUR |
EnTurbo™ SYBR Green PCR SuperMix(High ROX Premixed) |
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EQ013 | ELK Biotech | 5mL | 340 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-100G | Glentham Life Sciences | 100 g | 274.8 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-10G | Glentham Life Sciences | 10 g | 74.4 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-25G | Glentham Life Sciences | 25 g | 112.8 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-5G | Glentham Life Sciences | 5 g | 64.8 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-10 | Glentham Life Sciences | 10 | 31.7 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-100 | Glentham Life Sciences | 100 | 197.7 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-25 | Glentham Life Sciences | 25 | 63.3 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-5 | Glentham Life Sciences | 5 | 23.8 EUR |
Deoxy+ SYBR Green OneStep qRT-PCRKit wi ROX, 100 preps |
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FYT504-100P | Yeastern Biotech | 1 vial | Ask for price |
Deoxy+ SYBR Green OneStep qRT-PCRwi ROX Kit, 50 preps |
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FYT504-50P | Yeastern Biotech | 1 vial | Ask for price |
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix |
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Q411-02 | Vazyme | 500 rxns (20 μl/rxn) | 112.5 EUR |
ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix |
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Q411-03 | Vazyme | 2,500 rxns (20 μl/rxn) | 507.2 EUR |
In der vorliegenden Studie berichten wir über die Entwicklung eines hochempfindlichen Echtzeit-Schnell-qPCR-Assays auf Basis von SYBR® Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV, der aufgrund seiner Kombination aus Zyklusschritten und schnelleren Temperaturänderungen schneller ist als andere aktuelle Assays , schnellere Enzyme und ist so empfindlich, dass sehr geringe Viruskonzentrationen im Darminhalt von Tieren mit oder ohne klinische Anzeichen einer Darmerkrankung nachgewiesen werden können.