Abstrakt
Viele Viren wurden mit dem Runting and Stunting Syndrome (RSS) in Verbindung gebracht. Diese Virusinfektionen betreffen hauptsächlich junge Hühner und verursachen Apathie, Depressionen, zerzauste Federn, Klumpenbildung und Durchfall. Hühner-Parvovirus (ChPV) ist eine solche Infektion und wurde weltweit bei Hühnern nachgewiesen, die Anzeichen von Darmerkrankungen zeigten. Daher zielt die vorliegende Studie darauf ab, einen sensitiven Echtzeit-Schnell-qPCR-Assay auf Basis von SYBR Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV zu entwickeln.
Ein 561-bp-nichtstrukturelles (NS)-Gen wurde amplifiziert und kloniert, und ein Primerpaar wurde basierend auf konservierten Nukleotidsequenzen auf dem NS-Gen von ChPV entworfen, das interkalierende DNA-Reagenz SYBR Green wurde verwendet und der Fast-Modus von Es wurde ein Thermocycler verwendet. Der Assay weist 109 bis 101 Kopien des Genoms (CG) nach. Die Nachweisgrenze (LoD) wurde auf fünf CG und die Bestimmungsgrenze (LoQ) auf zehn CG geschätzt. Die Effizienz der Standardkurve betrug 101,94 %, und die Schmelzkurve zeigte einen einzigartigen sauberen Peak und eine Schmelztemperatur von 79,3 °C. Der Assay war spezifisch für die Amplifikation des ChPV-NS-Gens, und es wurde keine Amplifikation von anderen viralen Genomen oder in den Negativkontrollen gezeigt. Insgesamt wurden 141 Proben mit dem Assay getestet, von denen 139 Proben positiv befunden wurden. Der höchste CG-Wert von ChPV betrug 5,7 × 10 6 CG/μL DNA ohne offensichtliche klinische Anzeichen einer enterischen Störung, und 4,6 × 10 6 CG/μL DNA wurden bei Hühnern mit RSS nachgewiesen.
Einführung
Das Runting-Stunting-Syndrom (RSS) ist ein Erreger, der junge, eine Woche alte Küken befällt und eine schlechte Futterverwertung, Wachstumsverzögerung, Zwergwuchs, Keulung und Sterblichkeit verursacht [1,2,3].
- Im Allgemeinen zeigen die Küken Depressionen, Apathie, zerzauste Federn, Kloakenverklebungen und die charakteristischsten Anzeichen, Durchfall und Unsicherheit [3,4].
- Die ätiologischen Erreger im Zusammenhang mit RSS bleiben unbekannt; Es wurden jedoch viele Viren entdeckt und als Erreger der Krankheit in Verbindung gebracht, darunter Astroviren, Coronaviren, Rotaviren, Reovirus, Parvovirus und andere [5,6,7,8,9,10].
- Parvovirus ist ein viraler Erreger, der viele Tiere befällt, darunter Säugetiere wie Kühe, Hunde, Katzen, Ratten und Fledermäuse [11]. Viele experimentelle Infektionen wurden mit isolierten enterischen Viren wie Astrovirus, Vogelnephritisvirus (ANV), Rotavirus und Chicken Parvovirus (ChVP) durchgeführt, um die Pathogenese von RSS aufzuklären [6,12,13].
- Diese Studien haben ergeben, dass ChPV ein ätiologisches Agens im Zusammenhang mit RSS sein könnte und als Hauptverursacher dieser Darmerkrankung angesehen werden könnte [3,14].
- Zusätzlich verursacht ChPV bei Barbarie-Enten die Derzsy-Krankheit [15].
- Bei Hühnern war es mit einer Krümmung der Zwölffingerdarmschlinge, Pankreasatrophie und Mesenteritis verbunden [16], und es wurde bei Hühnern und Puten mit Anzeichen von Darmerkrankungen und bei scheinbar gesunden Tieren nachgewiesen [17,18,19].
ChPV ist ein unbehülltes, doppelsträngiges DNA-Virus mit positivem Sinn, von dem erstmals berichtet wurde, dass es Darmstörungen bei 10 Tage alten Küken verursacht [4].
Danach wurden viele andere Studien durchgeführt, um die Rolle von ChPV bei enterischen Erkrankungen, Durchfall und anderen enterischen Manifestationen aufzuklären [3,13]. Das vollständig zusammengesetzte ChPV-Genom hat eine Länge von 5275 bp und ist im nichtstrukturellen (NS) Gen organisiert, das ein nichtstrukturelles Protein kodiert und ORF1 und ORF2 enthält, die Proteine, die an der viralen Replikation beteiligt sind; die VP1- und VP2-Gene, die die Strukturproteine codieren, aus denen das virale Kapsid besteht, und das NP1-Gen, das ORF3 enthält, das sich zwischen ORF1 und ORF2 befindet [20]. Basierend auf den Sequenzen dieser Gene wurden ein PCR-Endpunkt und Echtzeit-PCR (qPCR)-Assays zur Identifizierung von ChPV entwickelt [21]. Die Mehrzahl dieser Assays konzentrierte sich auf das NS-Gen [8,22,23], da es das am stärksten konservierte Gen in ChPV ist. Der erste entwickelte PCR-Assay wurde von Zsak et al. [8], wo die Primer eine konservierte Region des NS-Gens flankierten, und derzeit wurden zwei qPCR-Assays basierend auf derselben NS-Region entwickelt [22]. Ein weiterer qPCR-Assay wurde entwickelt, um einen Teil der VP2-Genregion zu amplifizieren [21]. Alle diese Assays zeigten eine hohe Sensitivität für den Nachweis und die Quantifizierung von ChPV. In den brasilianischen Hühnerherden wurden in den letzten Jahren viele RSS-Ausbrüche gemeldet, bei denen ChPV nachgewiesen und das NS-Gen sequenziert wurde, was bestätigte, dass die Sequenzen zu ChPV gehörten, wodurch das Virus bereits bei jungen und alten Hühnern identifiziert wurde erster Tag der Infektion [9,16,24,25,26]. Enterische Erkrankungen verursachen wirtschaftliche Verluste bei Geflügel, den Wertverlust von Geflügelbeständen und eine erhöhte Anfälligkeit für andere Krankheiten, daher sollte ein schneller, wirksamer, erschwinglicher und zuverlässiger Assay für die Diagnose des ätiologischen Erregers standardisiert werden [27,28,29].
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21204 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
Genious 2X SYBR GREEN FAST qPCR MIX (No ROX) |
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RK21205 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix |
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RK21203 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21202 | Bimake | 5 mL | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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B21203 | Bimake | 25 mL | 1027.2 EUR |
Genious 2X SYBRGREEN FAST qPCR MIX (Low ROX) |
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RK21206 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21402 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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B21403 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21702 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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B21703 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix |
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HY-K0501 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns) | 315.6 EUR |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps 1.25 ml | Ask for price |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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FYT103-400P | Yeastern Biotech | 400 Preps 1.25 ml x 4 | Ask for price |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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HY-K0521 | MedChemExpress | 1 mL (100 rxns) | 135.6 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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HY-K0522 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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HY-K0523 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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Q111-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
SYBR Green I |
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B1747-25 | Biovision | each | 1396.8 EUR |
SYBR Green I |
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B1747-5 | Biovision | each | 464.4 EUR |
ABScript II One Step SYBR Green RT-qPCR Kit |
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RK20404 | Abclonal | 10 RXN | Ask for price |
Genious 2X SYBRGREEN FASTqPCR MIX (High ROX) |
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RK21207 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-1 | Biovision | each | 744 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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B1748-500 | Biovision | each | 516 EUR |
OPTIONAL GREEN FILTER (572NM) |
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GDBL-GREEN | CORNING | 1/pk | 1262.4 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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67008 | AAT Bioquest | 1 Plate | 97 EUR |
Fast Green FCF |
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abx082188-5g | Abbexa | 5 g | 243.6 EUR |
Fast Green FCF |
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HY-D0914 | MedChemExpress | 500mg | 129.6 EUR |
Fast Green FCF |
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FB0452 | Bio Basic | 5g | 66.26 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 79.2 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 115.2 EUR |
Fast Green Solution |
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FGN999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 148.8 EUR |
Green qPCR SuperMix |
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20-abx098031 | Abbexa |
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25G Fast Green FCF |
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NAT1348 | Scientific Laboratory Supplies | 25G | 150.48 EUR |
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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Q511-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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Q511-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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Q711-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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Q711-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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MasterMix-iC | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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MasterMix-iC-XL | ABM | 16 x 1.25 ml for 2000 reactions (20 ul) | 451.2 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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MasterMix-KC | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-ROX |
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MasterMix-KR | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-ROX |
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MasterMix-P | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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MasterMix-PC | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-Multiplex |
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MasterMix-PM | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-ROX |
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MasterMix-R | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-ROX |
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MasterMix-R-XL | ABM | 16 x 1.25 ml for 2000 reactions (20 ul) | 451.2 EUR |
Green qPCR SuperMix UDG |
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20-abx098032 | Abbexa |
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Top Green qPCR SuperMix |
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20-abx098033 | Abbexa |
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Tip Green qPCR SuperMix |
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20-abx098034 | Abbexa |
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Bio-Star Mastermix with SYBR (2X) BLUE |
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Y220 | GeneOn | 100 rcs (2,5 ml) | 112.8 EUR |
LncRNA Profiler Complete qPCR Array Kit (cDNA synthesis kit, qPCR array and SYBR Green reagent) 20 profiles |
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RA910A-1 | SBI | 20 profiles | 1329.6 EUR |
Methylamp MS-qPCR Fast Kit |
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P-1028-100 | EpiGentek | 100 Reactions | 213.4 EUR |
Methylamp MS-qPCR Fast Kit |
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P-1028-200 | EpiGentek | 200 Reactions | 380.6 EUR |
Methylamp MS-qPCR Fast Kit |
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P-1028 | EpiGentek |
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Fast Eva QPCR SuperMix Kit |
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K5052002 | Biochain | 200 rxn | 188 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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17276 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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17277 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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17278 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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17279 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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17280 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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17281 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 2500 reactions (1x25ml, 2x1.25ml) |
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PR2120-N-25BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 2695 EUR |
Accuris SYBR Green One-Step RT-qPCR Kit, No ROX, 5000 reactions (1x50ml, 4x1.25ml) |
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PR2120-N-50BLK | Benchmark Scientific | 1 each | 4785 EUR |
miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix |
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MQ101-01 | Vazyme | 125 rxn(20 μl/rxn) | 165.6 EUR |
miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix |
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MQ101-02 | Vazyme | 500 rxn(20 μl/rxn) | 290.4 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-100G | Glentham Life Sciences | 100 g | 274.8 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-10G | Glentham Life Sciences | 10 g | 74.4 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-25G | Glentham Life Sciences | 25 g | 112.8 EUR |
Fast Green FCF (C.I. 42053) |
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GT3407-5G | Glentham Life Sciences | 5 g | 64.8 EUR |
BrightGreen Express 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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MasterMix-EC | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen Express 2X qPCR MasterMix-ROX |
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MasterMix-ER | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-Low ROX |
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MasterMix-KL | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye |
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MasterMix-KS | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-Low ROX |
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MasterMix-LR | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-Low ROX |
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MasterMix-LR-XL | ABM | 16 x 1.25 ml for 2000 reactions (20 ul) | 451.2 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-Low ROX |
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MasterMix-PL | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-No Dye |
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MasterMix-PS | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye |
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MasterMix-S | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye |
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MasterMix-S-XL | ABM | 16 x 1.25 ml for 2000 reactions (20 ul) | 451.2 EUR |
Entrans 2X qPCR Probe Master Mix |
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RK21208 | Abclonal | 40 RXN | Ask for price |
Bio-Star Mastermix with SYBR (2X) no dye |
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Y210 | GeneOn | 100 rcs (2,5 ml) | 106.8 EUR |
Bio-Star Mastermix with SYBR (2X) High-ROX |
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Y240 | GeneOn | 100 rcs (2,5 ml) | 122.4 EUR |
Bio-Star Mastermix with SYBR (2X) Low-ROX |
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Y250 | GeneOn | 100 rcs (2,5 ml) | 122.4 EUR |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain |
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HY-K1004 | MedChemExpress | 100 μL | 135.6 EUR |
Morpheus HT-96 Green Screen |
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M-MD1-47-GREEN | MiTeGen | 96 x 1 ml ml | 280 EUR |
One.Step RT-qPCR Probe Kit (2X concentrated) |
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105-500 | GeneOn | 2 x 1,25 ml | 549.6 EUR |
One.Step RT-qPCR Probe Kit (2X concentrated) |
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105-502 | GeneOn | 10 x 1,25 ml | 2062.8 EUR |
BrightGreen Express 2X qPCR MasterMix-Low ROX |
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MasterMix-EL | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen Express 2X qPCR MasterMix-No Dye |
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MasterMix-ES | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
PLATEMAX ULTRA CLEAR PERMANENT HEAT SEALING FILM FOR QPCR, 100/500 |
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HS-100-QPCR | CORNING | 100/pk | 381.6 EUR |
PLATEMAX ULTRA CLEAR PEELABLE HEAT SEALING FILM FOR QPCR. 100/500 |
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HS-150-QPCR | CORNING | 100/pk | 381.6 EUR |
Top Green qPCR SuperMix (+Dye II) |
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20-abx098890 | Abbexa |
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Tip Green qPCR SuperMix (+Dye II) |
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20-abx098891 | Abbexa |
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HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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BS9291 | Bio Basic | 5X1mL, 5ml | 251.4 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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BS9292 | Bio Basic | 1ml | 115.68 EUR |
Safe-Green™ 2X PCR Taq MasterMix |
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G472 | ABM | 5.0 ml (200 Rxns) | 127.2 EUR |
Cyber Green™ [Equivalent to SYBR® Green] *20X Aqueous PCR Solution* |
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17591 | AAT Bioquest | 5x1 ml | 262.8 EUR |
Cyber Green™ [Equivalent to SYBR® Green] *10,000X Aqueous PCR Solution* |
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17592 | AAT Bioquest | 1 ml | 1051.2 EUR |
Fast Pro QPCR SuperMix Kit - ROX premixed |
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K5058200 | Biochain | 200 reactions | 253.2 EUR |
In der vorliegenden Studie berichten wir über die Entwicklung eines hochempfindlichen Echtzeit-Schnell-qPCR-Assays auf Basis von SYBR® Green zum Nachweis und zur Quantifizierung von ChPV, der aufgrund seiner Kombination aus Zyklusschritten und schnelleren Temperaturänderungen schneller ist als andere aktuelle Assays , schnellere Enzyme und ist so empfindlich, dass sehr geringe Viruskonzentrationen im Darminhalt von Tieren mit oder ohne klinische Anzeichen einer Darmerkrankung nachgewiesen werden können.