Einführung
Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) ist eine leistungsstarke Technik zum Nachweis des anfänglichen DNA-Eintrags in eine PCR-Reaktion durch Akkumulation von Fluoreszenzsignalen. Der DNA-Doppelstrang-gebundene Farbstoff SYBR Green I ist der am häufigsten verwendete Farbstoff in der qPCR.
ABclonal 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix enthält einen neuartigen universellen Referenzfarbstoff, der eine höhere Signalauflösung realisieren kann und für alle derzeit verwendeten qPCR-Instrumente geeignet ist (einschließlich Maschinen mit hohem ROX-Modus, niedrigem ROX-Modus und ohne ROX-Modus). Es auch enthält Hot-Start Taq DNA-Polymerase, um unerwartete Amplifikationsergebnisse zu vermeiden.
Außerdem ist ABclonal 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix ein optimierter qPCR-Reaktionsmix. Er enthält alle erforderlichen Komponenten in qPCR außer Primern und Template. Es ist bequem für Experimente und für mehrere Arten geeignet. Die oben genannten Eigenschaften machen es zu einem idealen Experimentierwerkzeug für die quantitative Genforschung.
Instrumente
Es ist kein zusätzlicher Referenzfarbstoff erforderlich. ABclonal 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix ist für alle derzeit verwendeten qPCR-Instrumente geeignet (einschließlich High-ROX-Modus, Low-ROX-Modus und No-ROX-Modus erforderlich).
Benötigte Materialien
1. EP-Röhrchen, PCR-Röhrchen und andere verwandte Materialien.
2. qPCR-spezifische Primer und Templates.
3. qPCR-Platten und Siegelmembran.
Nutzungshinweise
1. Bevor Sie den 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix verwenden, stellen Sie bitte sicher, dass der Mix vollständig aufgetaut ist und stellen Sie ihn dann zur Verwendung auf Eis.
2. Mischen Sie andere qPCR-Komponenten mit Mix gründlich und vorsichtig durch Pipettieren oder Vortexen. Stellen Sie den Mix nach Gebrauch wieder auf -20 ℃ für eine längere Lagerung oder 4 ℃ für eine kurzzeitige Verwendung.
3. 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix enthält Taq-Polymerase, alle Vorgänge sollten auf Eis durchgeführt werden.
4. 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix enthält einen speziell entwickelten Referenzfarbstoff, der für alle derzeit verwendeten qPCR-Geräte geeignet ist. Es sollten keine zusätzlichen ROX-ähnlichen Referenzfarbstoffe hinzugefügt werden.
5. Zur Vermeidung von Kontaminationen werden Pipettenspitzen mit Filtern empfohlen.
6. Um bessere qPCR-Ergebnisse zu garantieren, wird ein DNA-Template in guter Qualität empfohlen.
Experiment:
(1) Lösen Sie den 2X Universal SYBR Green Fast qPCR-Mix bei Raumtemperatur auf und legen Sie ihn dann zur weiteren Verwendung auf Eis. Rühren Sie die Mischung vor Gebrauch gründlich um und zentrifugieren Sie sie, um die gesamte Lösung zu sammeln.
(2) Berechnen Sie die erforderliche Mischungsmenge, im Allgemeinen wird eine zusätzliche Menge von 10 % empfohlen.
(3) Lösung im Falle einer Kontamination in sterile PCR- oder EP-Röhrchen geben.
(4) Fügen Sie alle in der obigen Tabelle aufgeführten Komponenten hinzu, schütteln Sie die Röhrchen vorsichtig, um sie gründlich zu mischen (vermeiden Sie Blasen) und zentrifugieren Sie sie.
(5) Geben Sie die Reaktionslösung in qPCR-Platten und versiegeln Sie die Platten mit optischer Membran.
(6) Zentrifugieren Sie die qPCR-Platten bei 2500 U/min, um die gesamte Lösung zu sammeln.
Datenanalyse:
1. Zeichnen Sie eine Standardkurve gemäß den Ct-Werten des endogenen Gens. Der Wert von R2 sollte mehr als 0,98 betragen und die Steigung der Kurve sollte im Bereich von -3 bis -3,5 liegen, was die PCR bedeutet
Die Verstärkungseffizienz liegt im Bereich von 90 % bis 120 %.
2. Die Standardabweichung (STD) der Ct-Werte sollte weniger als 0,2 betragen und die Variation des Ct-Werts für verschiedene Experimente sollte weniger als 0,5 betragen (der Schwellenwert verschiedener Experimente sollte sein dasselbe beim Vergleich der Ct-Werte).
3. Die einzelne Schmelzkurve zeigt keine unspezifischen Amplifikationsprodukte oder Primer-Dimmer an, und der Tm-Wert in der Schmelzkurve liegt normalerweise im Bereich von 80 bis 95 ℃.
Fehlerbehebung
1） Schmelzkurve zeigt mehrere Peaks
a. Primer-Design ： Entwerfen Sie den Primer gemäß den grundlegenden Primer-Design-Protokollen.
b. Primer-Konzentration zu hoch: Verringern Sie die Primer-Konzentration
2） Ungewöhnliche Verstärkungskurven
a. Amplifikationskurve nicht glatt: Zu niedriges Amplifikationssignal, erhöhen Sie die Template-Eingabe und stellen Sie sicher, dass der qPCR-Mix ordnungsgemäß gelagert wird.
b. Inkonsistente Amplifikationskurve: Blasen verursachen anormale qPCR-Ergebnisse, zentrifugieren Sie die Platte, bevor Sie sie laufen lassen.
c. Anormale Amplifikationskurven: Der Standardgrundlinienwert des Geräts ist auf 3 bis 15 eingestellt, die Grundlinieneinstellung kann entsprechend den tatsächlichen Amplifikationsbedingungen geändert werden. Außerdem kann die Verschlechterung der Vorlage die Kurve beeinflussen.
3） Keine Amplifikationskurven nach der Reaktion
a. Nicht genügend PCR-Zyklen: Die Anzahl der PCR-Zyklen ist normalerweise auf 40 eingestellt. Es sollte beachtet werden, dass eine höhere Anzahl von Zyklen die Anzahl erhöhen kann
Hintergrundsignal.
b. Primerabbau: Verwenden Sie Elektrophorese, um die Integrität der Primer zu bestätigen.
c. Bestätigen Sie den Signalerfassungsschritt: Der Signalerfassungsschritt wird normalerweise so eingestellt, dass er nach dem Ausheilungs-Verlängerungsschritt für zwei Schritte erfolgt
qPCR und nach Verlängerungsschritt für dreistufige qCPR.
d. Vorlageneingabe zu niedrig：Erhöhen Sie die Vorlagenkonzentration oder fügen Sie zusätzliche Wiederholungen hinzu.
a. Vorlagenabbau: Verwenden Sie eine frisch zubereitete Vorlage (Verwenden Sie eine Elektrophorese, um die Integrität der Vorlage zu bestätigen)
b. Nicht genügend anfängliche Denaturierungszeit: 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix verwendet Hot-Start Taq-Polymerase, die Vordenaturierung Die Zeit sollte mindestens 3 Minuten betragen. 4） Ct-Wert zu spät
c. Niedrige Amplifikationseffizienz: Optimieren Sie die Reaktionsbedingungen oder wechseln Sie den Primer.
d. Template Input Too Low: Erhöhen Sie die Template-Konzentration oder fügen Sie eine zusätzliche Wiederholung hinzu
e. Vorlagenabbau: Verwenden Sie eine frisch zubereitete Vorlage (Verwenden Sie eine Elektrophorese, um die Integrität der Vorlage zu bestätigen)
f. Zu lange PCR-Produkte: Die Länge der Amplifikationsprodukte liegt normalerweise im Bereich von 70 bp bis 200 bp.
g. PCR Inhabitation Reagent：Verwenden Sie eine neue Vorlage oder verdünnen Sie die Vorlage.
h. Zu kurze Vordenaturierungszeit: 2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix enthält Hot-Start Taq-Polymerase, die Vordenaturierungszeit sollte mindestens 3 Minuten betragen.
5） NTC zeigt die Verstärkung an
a. Kontamination: Verwenden Sie steriles Wasser, um das Experiment durchzuführen, und es wird empfohlen, alle Vorgänge in einem Reinraum durchzuführen, um Aerosole zu vermeiden Kontamination.
b. Unspezifische PCR-Produkte: Analyse mit Schmelzkurve.
6） Inkonsistente Ergebnisse
c. Inkonsistente Probe hinzugefügt: Verwenden Sie die richtigen Pipettiertechniken
d. Inkonsistente Temperatur im qPCR-Gerät: Stellen Sie eine regelmäßige Gerätekalibrierung sicher.
e. Template Concentration Too Low：Je niedriger die Template-Eingabe, desto schlechter das qPCR-Ergebnis. Erhöhen Sie die Template-Konzentration.
2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix |
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| RK21203 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix |
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| RK21204 | Abclonal | 1 mL | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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| B21202 | Bimake | 5 mL | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix |
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| B21203 | Bimake | 25 mL | 1027.2 EUR |
Genious 2X SYBR GREEN FAST qPCR MIX (No ROX) |
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| RK21205 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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| B21402 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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| B21403 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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| B21702 | Bimake | 5 ml | 268.8 EUR |
2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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| B21703 | Bimake | 25 ml | 1027.2 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix |
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| HY-K0501 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns) | 315.6 EUR |
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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| Q511-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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| Q511-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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| Q711-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix |
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| Q711-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix |
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| MQ101-01 | Vazyme | 125 rxn(20 μl/rxn) | 165.6 EUR |
miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix |
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| MQ101-02 | Vazyme | 500 rxn(20 μl/rxn) | 290.4 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX) |
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| HY-K0521 | MedChemExpress | 1 mL (100 rxns) | 135.6 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) |
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| HY-K0522 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX) |
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| HY-K0523 | MedChemExpress | 5 mL (500 rxns ) | 308.4 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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| Q111-02 | Vazyme | 500 rxn (20 μl/rxn) | 265.2 EUR |
AceQ qPCR SYBR® Green Master Mix |
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| Q111-03 | Vazyme | 2500 rxn (20 μl/rxn) | 775.2 EUR |
Genious 2X SYBRGREEN FAST qPCR MIX (Low ROX) |
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| RK21206 | Abclonal | 1 ml | Ask for price |
HotTaq Probe qPCR Universal Mix |
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| BT11004 | Bioatlas | 250rxn | 147.6 EUR |
HotTaq EvaGreen qPCR Universal Mix |
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| BT11104 | Bioatlas | 250rxn | 165.6 EUR |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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| FYT103-100P | Yeastern Biotech | 100 Preps 1.25 ml | Ask for price |
Eztime Real - time PCRPremix 2x,SYBR Green |
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| FYT103-400P | Yeastern Biotech | 400 Preps 1.25 ml x 4 | Ask for price |
Entrans 2X qPCR Probe Master Mix |
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| RK21208 | Abclonal | 40 RXN | Ask for price |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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| BS9291 | Bio Basic | 5X1mL, 5ml | 251.4 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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| BS9292 | Bio Basic | 1ml | 115.68 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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| 17276 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *No ROX* |
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| 17277 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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| 17278 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *Low ROX* |
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| 17279 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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| 17280 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix with Helixyte™ Green *High ROX* |
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| 17281 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
SYBR Green I |
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| B1747-25 | Biovision | each | 1396.8 EUR |
SYBR Green I |
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| B1747-5 | Biovision | each | 464.4 EUR |
ABScript II One Step SYBR Green RT-qPCR Kit |
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| RK20404 | Abclonal | 10 RXN | Ask for price |
Fast EvaGreen Master Mix for qPCR(200 rxn) |
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| 31003 | Biotium | 2x1ML | 244.8 EUR |
Fast EvaGreen Master Mix for qPCR (500 rxn) |
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| 31003-1 | Biotium | 5x1ML | 463.2 EUR |
Fast EvaGreen Master Mix for qPCR (5000 rxn) |
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| 31003-2 | Biotium | 50x1ML | 3739.2 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix (500 rxn) |
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| 31020-1 | Biotium | 5x1mL | 524.4 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix (5000 rxn) |
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| 31020-2 | Biotium | 50x1mL | 4291.2 EUR |
ACCUZYME Mix, 2x |
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| BIO-25028 | Bioline | 500 Reactions | Ask for price |
MyTaq Mix, 2x |
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| BIO-25041 | Bioline | 200 Reactions | Ask for price |
MyTaq Mix, 2x |
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| BIO-25041/S | Bioline | Sample | Ask for price |
MyTaq Mix, 2x |
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| BIO-25042 | Bioline | 1000 Reactions | Ask for price |
MyFi Mix, 2x |
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| BIO-25049 | Bioline | 100 Reactions | Ask for price |
MyFi Mix, 2x |
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| BIO-25049/S | Bioline | Sample | Ask for price |
MyFi Mix, 2x |
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| BIO-25050 | Bioline | 500 Reactions | Ask for price |
Ranger Mix, 2x |
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| BIO-25051/S | Bioline | Sample | Ask for price |
Ranger Mix, 2x |
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| BIO-25052 | Bioline | 500 Reactions | Ask for price |
Universal qPCR Mixture |
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| QPCR1000-UNIV | Bio Basic | 4X1.25ml | 331.44 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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| B1748-1 | Biovision | each | 744 EUR |
EZSolution? SYBR Green I |
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| B1748-500 | Biovision | each | 516 EUR |
OPTIONAL GREEN FILTER (572NM) |
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| GDBL-GREEN | CORNING | 1/pk | 1262.4 EUR |
SYBR Dye qPCR Calibration Plate *Optimized for ABI7500 Fast 96-Well* |
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| 67008 | AAT Bioquest | 1 Plate | 97 EUR |
Fast Green FCF |
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| FB0452 | Bio Basic | 5g | 66.26 EUR |
Fast Green Solution |
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| FGN125 | ScyTek Laboratories | 125 ml | 79.2 EUR |
Fast Green Solution |
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| FGN500 | ScyTek Laboratories | 500 ml | 115.2 EUR |
Fast Green Solution |
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| FGN999 | ScyTek Laboratories | 1000 ml | 148.8 EUR |
Fast Green FCF |
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| abx082188-5g | Abbexa | 5 g | 243.6 EUR |
Fast Green FCF |
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| HY-D0914 | MedChemExpress | 500mg | 129.6 EUR |
Green qPCR SuperMix |
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| 20-abx098031 | Abbexa |
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MyTaq Red Mix, 2x |
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| BIO-25043 | Bioline | 200 Reactions | Ask for price |
MyTaq Red Mix, 2x |
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| BIO-25043/S | Bioline | Sample | Ask for price |
MyTaq Red Mix, 2x |
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| BIO-25044 | Bioline | 1000 Reactions | Ask for price |
MyTaq HS Mix, 2x |
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| BIO-25045 | Bioline | 200 Reactions | Ask for price |
MyTaq HS Mix, 2x |
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| BIO-25045/S | Bioline | Sample | Ask for price |
MyTaq HS Mix, 2x |
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| BIO-25046 | Bioline | 1000 Reactions | Ask for price |
Green Taq Mix |
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| P131-01 | Vazyme | 5 ml | 142.8 EUR |
Green Taq Mix |
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| P131-02 | Vazyme | 15 ml | 180 EUR |
Green Taq Mix |
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| P131-03 | Vazyme | 50 ml | 297.6 EUR |
Fast EvaGreen Master Mix for qPCR, trial size (100 rxn) |
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| 31003-T | Biotium | 1ML | 147.6 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix (trial size, 100 rxn) |
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| 31020-T | Biotium | 1mL | 160.8 EUR |
5min Universal Ligation Mix |
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| C311-01 | Vazyme | 50 rxn | 256.8 EUR |
5min Universal Ligation Mix |
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| C311-02 | Vazyme | 100 rxn | 339.6 EUR |
Wire Rack 2x 6 Universal |
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| STA20020 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 30.67 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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| M-PCR-372L | MiTeGen | 10 x 1,25 ml | 720.29 EUR |
qPCR SybrMasterMaster mix for real-time qPCR with SYBR® Green fluorescent DNA stain** shipped ice packs - must be shipped via overnight service |
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| M-PCR-372S | MiTeGen | 2 x 1,25 ml | 180.14 EUR |
Volatile Organics Mix |
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| 60-BIG-MIX | Scientific Laboratory Supplies | 1ML | 120.84 EUR |
5 Component Mix |
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| AOAC-MIX-1 | Scientific Laboratory Supplies | EACH | 117.42 EUR |
25G Fast Green FCF |
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| NAT1348 | Scientific Laboratory Supplies | 25G | 150.48 EUR |
Fast Plus EvaGreen Master Mix for qPCR with Rox (200 rxn) |
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| 31014 | Biotium | 2x1mL | 273.6 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with low Rox (500 rxn) |
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| 31014-1 | Biotium | 5x1mL | 524.4 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with low Rox (5000 rxn) |
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| 31014-2 | Biotium | 50x1mL | 4291.2 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with high Rox (500 rxn) |
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| 31015-1 | Biotium | 5x1mL | 524.4 EUR |
Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with high Rox (5000 rxn) |
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| 31015-2 | Biotium | 50x1mL | 4291.2 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *No ROX* |
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| 17288 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *No ROX* |
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| 17289 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *Low ROX* |
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| 17290 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *Low ROX* |
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| 17291 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX* |
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| 17292 | AAT Bioquest | 1 mL | 99 EUR |
TAQuest™ FAST qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX* |
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| 17293 | AAT Bioquest | 5 mL | 308 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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| MasterMix-iC | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
BrightGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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| MasterMix-iC-XL | ABM | 16 x 1.25 ml for 2000 reactions (20 ul) | 451.2 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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| MasterMix-KC | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
KiloGreen 2X qPCR MasterMix-ROX |
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| MasterMix-KR | ABM | 4 x 1.25 ml - 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-ROX |
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| MasterMix-P | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
TaqProbe 2X qPCR MasterMix-iCycler |
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| MasterMix-PC | ABM | 4 x 1.25 ml for 500 reactions (20 ul) | 168 EUR |
f. Inkonsistenter Grenzwertsatz: Stellen Sie beim Vergleich der qPCR-Ergebnisse in verschiedenen Platten sicher, dass der Grenzwert für alle Experimente gleich ist.