Phosphothreonin-Antikörper (Biotin)

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)1 sind die größte Familie von zellulären Oberflächenrezeptoren, die Mediatoren zahlreicher physiologischer Reaktionen und die Ziele von 50 % des Therapeutikums
Drogen (1). Ihre Aktivierung erfolgt durch die Bindung spezifischer Liganden an die extrazelluläre Seite des Rezeptors, während die zelluläre Aktivierung durch Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Proteinen wie G-Proteinen vermittelt wird.

Nach der ligandenvermittelten Aktivierung sind GPCRs das Ziel regulatorischer Mechanismen, die zunächst darauf abzielen,die Signalisierungskapazität der Zelle zu beenden und dann wieder zu initiieren.

Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die GPCR-Prozessierung bei der Aktivierung von Src und bestimmten MAP-Kinase-Wegen wichtig ist (2). Das Protein Arrestin wurde zuerst als ein Protein charakterisiert, das an der GPCR-Desensibilisierung nach der Rezeptorphosphorylierung beteiligt ist, aber kürzlich wurde gezeigt, dass es mehrere Rollen in der Rezeptorfunktion spielt, einschließlich als Adapter für Clathrin-vermittelte Endozytose und als Gerüstprotein für Komponenten der MAP-Kinase-Kaskade ( 3). Angesichts unseres wachsenden Wissens über die vielen verschiedenen Funktionen von Arrestin ist es klar, dass ein besseres Verständnis seiner Wechselwirkungen mit GPCRs ist wesentlich.

• Arrestine umfassen eine Familie von vier bekannten Mitgliedern in Säugetieren: zwei visuelle Arrestine, 1 und 4, die in den Stäbchen- und Zapfenzellen der Retina gefunden werden, und zwei nicht-visuelle Arrestine, 2 und 3, die in den meisten gefunden werden andere Gewebe des Körpers (4). Die 2,8-Å-Kristallstruktur von visuellem Arrestin (5) und die 1,9-Å-Kristallstruktur von Arrestin-2 (6) weisen beide darauf hin, dass Arrestin als zweiteiliges Molekül vorliegt, das aus zwei siebensträngigen Sandwiches mit einem Netzwerk aus wasserstoffgebundenen Ladungen besteht Reste, die das bilden, was als polarer Kern (5) beschrieben wurde.
• Das aktuelle Modell von Arrestin-vermittelten Wechselwirkungen mit Liganden-besetzten GPCRs besagt, dass nach Ligandenbesetzung zytoplasmatische Regionen des Rezeptors an Serin- und Threoninresten durch ein Mitglied der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinasen phosphoryliert werden (7).
• Bei der Bindung von Arrestin zerstören diese phosphorylierten Reste den polaren Kern von Arrestin und induzieren eine Konformationsänderung innerhalb des Moleküls, die es ihm ermöglicht, weiter mit dem Rezeptor zu interagieren (8).
• Dieses Modell schlägt vor, dass die Bindung von Arrestin an den Rezeptor weitere Rezeptorinteraktionen blockiertmit G-Proteinen, vermutlich durch sterische Hemmung, wodurch eine weitere G-Protein-vermittelte zelluläre Aktivierung verhindert wird (9).

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Arrestine eine andere Rolle bei der Rezeptorsignalisierung als der Desensibilisierung spielen. Es wurde gezeigt, dass Arrestin als Adapterprotein wirkt, das sowohl mit dem Clathrin-Adapter AP-2 als auch mit Clathrin selbst interagiert, was zur Internalisierung einiger Arrestin-gebundener Rezeptoren über Clathrin-beschichtete Pits führt (10, 11).

Es wurde auch vorgeschlagen, dass Arrestin die Rate der Resensibilisierung und Reexpression von Rezeptoren basierend auf der Rate seiner Dissoziation vom internalisierten Rezeptor bestimmt (12, 13). Eine der neueren Beobachtungen von Arrestin war jedoch die Entdeckung, dass Arrestine als Gerüstproteine ​​in einigen MAP-Kinase-Kaskaden fungieren, insbesondere in Kaskaden, die zur JNK3- und ERK2-Aktivierung führen (14–17). Diese Studien haben die Rolle von Arrestin im Rezeptor erhöht Signalübertragung von einem desensibilisierenden Mittel zu einem aktiven und vielseitigen Teilnehmer an der Signaltransduktion.
Trotz der Bedeutung von Arrestin-GPCR-Wechselwirkungen ist wenig über die Rezeptordomänen und Mechanismen bekannt, die an der Arrestinbindung beteiligt sind. Mutageneseexperimente haben Arrestinregionen definiert, die an der Erkennung des Phosphorylierungsstatus sowie des Aktivierungsstatus (d. h. ob ein Ligand gebunden ist oder nicht) des Rezeptors beteiligt sind (6, 8, 18, 19). Der Austausch von Carboxyl-terminalen Domänen zwischen GPCRs hat auch gezeigt, dass das Muster der Rezeptor-Phosphorylierung in dieser Domäne die Raten der Rezeptor-Internalisierung und -Recycling/Resensibilisierung beeinflussen kann (13). Wir haben die Mechanismen der Rezeptoraktivierung, Desensibilisierung und Internalisierung unter Verwendung des Nformyl-Peptid-Rezeptors (FPR), eines Mitglieds der Rezeptorfamilie der Chemolockstoffe/Chemokine, untersucht (20, 21). Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Rezeptorphosphorylierung entscheidend für die Arrestinbindung ist (22, 23), ebenso wie das Vorhandensein des hochkonservierten „DRY“-Motivs (24). Arrestin-Wechselwirkungen mit dem FPR sind jedoch für die FPR-Internalisierung oder die Verhinderung der G-Protein-Bindung nicht erforderlich, da wir kürzlich gezeigt haben, dass die Rezeptorphosphorylierung allein ausreichen kann, um G-Protein-Wechselwirkungen in Abwesenheit von Arrestin zu blockieren (22, 23). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die primäre Rolle von Arrestin in bestimmten GPCR-Systemen tatsächlich darin bestehen könnte, als Adapter und Gerüst zu fungieren.
In dieser Studie untersuchten wir die Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der Arrestin-Familie mit der phosphorylierten carboxylterminalen Domäne des FPR unter Verwendung eines Bead-basierten, zellfreien Assays. Es wurden biotinylierte Peptide synthetisiert, die die 47 Reste des FPR-Carboxylterminus sowohl phosphoryliert als auch unphosphoryliert darstellen Zustand und an Streptavidin-beschichtete Polystyrolkügelchen gebunden, die dann mit Fluorescein-konjugierten Arrestinen inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert wurden, um die Arrestinbindung zu bestimmen. Wir fanden heraus, dass Arrestine Carboxyl-terminale Peptide in einer phosphorylierungsabhängigen Weise banden.
Verkürzte Arrestine, die normalerweise intakte Rezeptoren in a binden phosphorylierungsunabhängig, auch nur phosphorylierte Peptide an Beads gebunden.

Zusätzlich Direktbindung u Kompetitionsassays zeigen, dass verkürzte Arrestine binden
das phosphorylierte carboxylterminale Peptid mit signifikant höherer Affinität als Arrestine voller Länge. Im Vergleich mit phosphorylierungsunabhängigen Varianten von Arrestin in voller Länge zeigen unsere Ergebnisse eine wichtige Rolle für die carboxyterminale Domäne von Arrestin bei der Kontrolle der Affinität von Bindungswechselwirkungen mit phosphorylierten Rezeptordomänen.