G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)1 sind die größte Familie von zellulären Oberflächenrezeptoren, die Mediatoren zahlreicher physiologischer Reaktionen und die Ziele von 50 % des Therapeutikums
Drogen (1). Ihre Aktivierung erfolgt durch die Bindung spezifischer Liganden an die extrazelluläre Seite des Rezeptors, während die zelluläre Aktivierung durch Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Proteinen wie G-Proteinen vermittelt wird.
Nach der ligandenvermittelten Aktivierung sind GPCRs das Ziel regulatorischer Mechanismen, die zunächst darauf abzielen,die Signalisierungskapazität der Zelle zu beenden und dann wieder zu initiieren.
Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die GPCR-Prozessierung bei der Aktivierung von Src und bestimmten MAP-Kinase-Wegen wichtig ist (2). Das Protein Arrestin wurde zuerst als ein Protein charakterisiert, das an der GPCR-Desensibilisierung nach der Rezeptorphosphorylierung beteiligt ist, aber kürzlich wurde gezeigt, dass es mehrere Rollen in der Rezeptorfunktion spielt, einschließlich als Adapter für Clathrin-vermittelte Endozytose und als Gerüstprotein für Komponenten der MAP-Kinase-Kaskade ( 3). Angesichts unseres wachsenden Wissens über die vielen verschiedenen Funktionen von Arrestin ist es klar, dass ein besseres Verständnis seiner Wechselwirkungen mit GPCRs ist wesentlich.
- Arrestine umfassen eine Familie von vier bekannten Mitgliedern in Säugetieren: zwei visuelle Arrestine, 1 und 4, die in den Stäbchen- und Zapfenzellen der Retina gefunden werden, und zwei nicht-visuelle Arrestine, 2 und 3, die in den meisten gefunden werden andere Gewebe des Körpers (4). Die 2,8-Å-Kristallstruktur von visuellem Arrestin (5) und die 1,9-Å-Kristallstruktur von Arrestin-2 (6) weisen beide darauf hin, dass Arrestin als zweiteiliges Molekül vorliegt, das aus zwei siebensträngigen Sandwiches mit einem Netzwerk aus wasserstoffgebundenen Ladungen besteht Reste, die das bilden, was als polarer Kern (5) beschrieben wurde.
- Das aktuelle Modell von Arrestin-vermittelten Wechselwirkungen mit Liganden-besetzten GPCRs besagt, dass nach Ligandenbesetzung zytoplasmatische Regionen des Rezeptors an Serin- und Threoninresten durch ein Mitglied der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinasen phosphoryliert werden (7).
- Bei der Bindung von Arrestin zerstören diese phosphorylierten Reste den polaren Kern von Arrestin und induzieren eine Konformationsänderung innerhalb des Moleküls, die es ihm ermöglicht, weiter mit dem Rezeptor zu interagieren (8).
- Dieses Modell schlägt vor, dass die Bindung von Arrestin an den Rezeptor weitere Rezeptorinteraktionen blockiertmit G-Proteinen, vermutlich durch sterische Hemmung, wodurch eine weitere G-Protein-vermittelte zelluläre Aktivierung verhindert wird (9).
Jüngste Studien haben gezeigt, dass Arrestine eine andere Rolle bei der Rezeptorsignalisierung als der Desensibilisierung spielen. Es wurde gezeigt, dass Arrestin als Adapterprotein wirkt, das sowohl mit dem Clathrin-Adapter AP-2 als auch mit Clathrin selbst interagiert, was zur Internalisierung einiger Arrestin-gebundener Rezeptoren über Clathrin-beschichtete Pits führt (10, 11).
Es wurde auch vorgeschlagen, dass Arrestin die Rate der Resensibilisierung und Reexpression von Rezeptoren basierend auf der Rate seiner Dissoziation vom internalisierten Rezeptor bestimmt (12, 13). Eine der neueren Beobachtungen von Arrestin war jedoch die Entdeckung, dass Arrestine als Gerüstproteine in einigen MAP-Kinase-Kaskaden fungieren, insbesondere in Kaskaden, die zur JNK3- und ERK2-Aktivierung führen (14–17). Diese Studien haben die Rolle von Arrestin im Rezeptor erhöht Signalübertragung von einem desensibilisierenden Mittel zu einem aktiven und vielseitigen Teilnehmer an der Signaltransduktion.
Trotz der Bedeutung von Arrestin-GPCR-Wechselwirkungen ist wenig über die Rezeptordomänen und Mechanismen bekannt, die an der Arrestinbindung beteiligt sind. Mutageneseexperimente haben Arrestinregionen definiert, die an der Erkennung des Phosphorylierungsstatus sowie des Aktivierungsstatus (d. h. ob ein Ligand gebunden ist oder nicht) des Rezeptors beteiligt sind (6, 8, 18, 19). Der Austausch von Carboxyl-terminalen Domänen zwischen GPCRs hat auch gezeigt, dass das Muster der Rezeptor-Phosphorylierung in dieser Domäne die Raten der Rezeptor-Internalisierung und -Recycling/Resensibilisierung beeinflussen kann (13). Wir haben die Mechanismen der Rezeptoraktivierung, Desensibilisierung und Internalisierung unter Verwendung des Nformyl-Peptid-Rezeptors (FPR), eines Mitglieds der Rezeptorfamilie der Chemolockstoffe/Chemokine, untersucht (20, 21). Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass die Rezeptorphosphorylierung entscheidend für die Arrestinbindung ist (22, 23), ebenso wie das Vorhandensein des hochkonservierten „DRY“-Motivs (24). Arrestin-Wechselwirkungen mit dem FPR sind jedoch für die FPR-Internalisierung oder die Verhinderung der G-Protein-Bindung nicht erforderlich, da wir kürzlich gezeigt haben, dass die Rezeptorphosphorylierung allein ausreichen kann, um G-Protein-Wechselwirkungen in Abwesenheit von Arrestin zu blockieren (22, 23). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die primäre Rolle von Arrestin in bestimmten GPCR-Systemen tatsächlich darin bestehen könnte, als Adapter und Gerüst zu fungieren.
In dieser Studie untersuchten wir die Wechselwirkungen zwischen Mitgliedern der Arrestin-Familie mit der phosphorylierten carboxylterminalen Domäne des FPR unter Verwendung eines Bead-basierten, zellfreien Assays. Es wurden biotinylierte Peptide synthetisiert, die die 47 Reste des FPR-Carboxylterminus sowohl phosphoryliert als auch unphosphoryliert darstellen Zustand und an Streptavidin-beschichtete Polystyrolkügelchen gebunden, die dann mit Fluorescein-konjugierten Arrestinen inkubiert und durch Durchflusszytometrie analysiert wurden, um die Arrestinbindung zu bestimmen. Wir fanden heraus, dass Arrestine Carboxyl-terminale Peptide in einer phosphorylierungsabhängigen Weise banden.
Verkürzte Arrestine, die normalerweise intakte Rezeptoren in a binden phosphorylierungsunabhängig, auch nur phosphorylierte Peptide an Beads gebunden.
Phosphothreonine Antibody (Biotin) |
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abx448368-400ul | Abbexa | 400 ul | 592 EUR |
Phosphothreonine antibody (biotin) |
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60R-PR002bt | Fitzgerald | 100 ug | 840 EUR |
Rabbit Anti Phosphothreonine Polyclonal Antibody,Biotin |
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DPBT-68215RP | Creative Diagnostics | 50 µg | 881 EUR |
Phosphothreonine Antibody |
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abx448440-400ul | Abbexa | 400 ul | 537 EUR |
Phosphothreonine antibody |
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20C-CR1334RP | Fitzgerald | 100 ug | 133 EUR |
Phosphothreonine antibody |
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70R-PR006 | Fitzgerald | 100 ug | 133 EUR |
CX3CR1 Antibody (biotin) |
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2093-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 171.82 EUR |
CX3CR1 Antibody (biotin) |
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2093-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 436.42 EUR |
ACE2 Antibody (biotin) |
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3217-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 191.42 EUR |
ACE2 Antibody (biotin) |
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3217-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 495.22 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-152F | Stressmarq | 0.4ml | 418 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F | Stressmarq | 0.4ml | 362 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A390 | Stressmarq | 0.4ml | 409 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A488 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A565 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A594 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A633 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A655 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A680 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-A700 | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-ALP | Stressmarq | 0.4ml | 403 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-APC | Stressmarq | 0.4ml | 408 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-APCCY7 | Stressmarq | 0.4ml | 480 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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Antibody for Phosphothreonine |
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Antibody for Phosphothreonine |
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Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-FITC | Stressmarq | 0.4ml | 401 EUR |
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SPC-154F-P594 | Stressmarq | 0.4ml | 415 EUR |
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Antibody for Phosphothreonine |
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SPC-154F-RPE | Stressmarq | 0.4ml | 406 EUR |
Antibody for Phosphothreonine |
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Phosphothreonine Antibody (FITC) |
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abx448394-400ul | Abbexa | 400 ul | 592 EUR |
Phosphothreonine Antibody (RPE) |
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Phosphothreonine Antibody (Streptavidin) |
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abx448410-400ul | Abbexa | 400 ul | 592 EUR |
Phosphothreonine Antibody (HRP) |
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abx448441-400ul | Abbexa | 400 ul | 606 EUR |
Phosphothreonine-Pro antibody |
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20R-PR017 | Fitzgerald | 100 ug | 133 EUR |
PD1 Antibody [7H6] (biotin) |
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RF16003-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 191.42 EUR |
PD1 Antibody [7H6] (biotin) |
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RF16003-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 495.22 EUR |
PDL1 Antibody [8E12] (biotin) |
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RF16032-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 191.42 EUR |
PDL1 Antibody [8E12] (biotin) |
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RF16032-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 495.22 EUR |
TIGIT Antibody [10B1] (biotin) |
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RF16058-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 191.42 EUR |
TIGIT Antibody [10B1] (biotin) |
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RF16058-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 495.22 EUR |
TIM3 Antibody [10C10] (biotin) |
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RF16103-biotin-002mg | ProSci | 0.02 mg | 191.42 EUR |
TIM3 Antibody [10C10] (biotin) |
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RF16103-biotin-01mg | ProSci | 0.1 mg | 495.22 EUR |
Monoclonal Anti-Phosphothreonine (PY20) IgG-Biotin conjugate |
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PTHR12-BTN | Alpha Diagnostics | 100 ul | 408 EUR |
Anti-human CD14 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00137-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD11b Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00144-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD19 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00154-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD38 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00193-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD25 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00214-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD4 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00344-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD5 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00480-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD45 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00555-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD2 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00570-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD71 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00591-Biotin | BosterBio | 100µg | 245 EUR |
Anti-human CD62L Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00652-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD59 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00914-Biotin | BosterBio | 100µg | 265 EUR |
Anti-human CD117 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC01335-Biotin | BosterBio | 100μg | 224 EUR |
Anti-human CD32 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC01450-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD90 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC01818-Biotin | BosterBio | 100µg | 268 EUR |
Anti-human CD7 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC01974-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD235a Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC02184-Biotin | BosterBio | 100µg | 245 EUR |
Anti-human CD8 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC02236-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-Human VEGI Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC02402-Biotin | BosterBio | Various Sizes | 497 EUR |
Anti-human CD3 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC02675-Biotin | BosterBio | 100µg | 152 EUR |
Anti-human CD20 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC03780-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD10 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC04065-Biotin | BosterBio | 100µg | 189 EUR |
Anti-human CD57 Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC09548-Biotin | BosterBio | 100µg | 245 EUR |
Anti-human HLA-DR Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00568-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Anti-human CD55/Daf Monoclonal Antibody Biotin Conjugated, Flow Validated |
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FC00910-Biotin | BosterBio | 100µg | 233 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D | Stressmarq | 0.1ml | 322 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A390 | Stressmarq | 0.1ml | 369 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A488 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A565 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A594 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A633 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A655 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A680 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-A700 | Stressmarq | 0.1ml | 368 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-ALP | Stressmarq | 0.1ml | 362 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-APC | Stressmarq | 0.1ml | 367 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-APCCY7 | Stressmarq | 0.1ml | 440 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-BI | Stressmarq | 0.1ml | 364 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-DY350 | Stressmarq | 0.1ml | 383 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-DY405 | Stressmarq | 0.1ml | 371 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-DY488 | Stressmarq | 0.1ml | 361 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-DY594 | Stressmarq | 0.1ml | 363 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-DY633 | Stressmarq | 0.1ml | 359 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-FITC | Stressmarq | 0.1ml | 360 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-HRP | Stressmarq | 0.1ml | 357 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-P594 | Stressmarq | 0.1ml | 375 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-PCP | Stressmarq | 0.1ml | 367 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-RPE | Stressmarq | 0.1ml | 365 EUR |
Monoclonal antibody for Phosphothreonine |
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SMC-158D-STR | Stressmarq | 0.1ml | 366 EUR |
Phosphothreonine Antibody (ATTO 390) |
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abx448288-400ul | Abbexa | 400 ul | 592 EUR |
Zusätzlich Direktbindung u Kompetitionsassays zeigen, dass verkürzte Arrestine binden
das phosphorylierte carboxylterminale Peptid mit signifikant höherer Affinität als Arrestine voller Länge. Im Vergleich mit phosphorylierungsunabhängigen Varianten von Arrestin in voller Länge zeigen unsere Ergebnisse eine wichtige Rolle für die carboxyterminale Domäne von Arrestin bei der Kontrolle der Affinität von Bindungswechselwirkungen mit phosphorylierten Rezeptordomänen.