Antikörper für CD9

Abstrakt
Die subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE) ist eine langsam fortschreitende und höchst tödliche Erkrankung des zentralen Nervensystems. Obwohl angenommen wird, dass die Hauptursache von SSPE eine anhaltende Infektion von Neuronen- und Gliazellen durch ein Masernvirus ist, wurde der genaue Mechanismus des Fortschreitens dieser Krankheit noch nicht aufgeklärt. CD9, ein Mitglied der Tetraspanin-Familie, wird im Myelin und anderen Nervengeweben exprimiert.

Diese Studie wies signifikante Mengen an Anti-CD9-Antikörpern in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) aller in die Studie eingeschlossenen Patienten mit SSPE nach. Anti-CD9-Antikörper wurden auch im Liquor einiger Patienten mit anderen neurologischen Störungen nachgewiesen, aber diese Patienten wiesen niedrigere Spiegel von Anti-CD9-Antikörpern auf als die Patienten mit SSPE. Der Spiegel an Anti-CD9-Antikörpern war erhöht und erreichte einen Höhepunkt, der mit dem Auftreten von Hirnatrophie zusammenfiel. Diese Ergebnisse beleuchten einen neuen Aspekt der Ursachen und des Verlaufs von SSPE.

Die subakute sklerosierende Panenzephalitis (SSPE) ist eine langsam fortschreitende und hochgradig tödliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die bei Kindern und jungen Erwachsenen auftritt.

Obwohl angenommen wird, dass die primäre Ursache von SSPE die anhaltende Infektion von Neuronen- und Gliazellen durch ein fehlerhaftes Masernvirus ist [1], wurde der genaue Mechanismus des Fortschreitens dieser Krankheit noch nicht aufgeklärt.

• CD9 ist ein Glykoprotein von 24–27 kDa, das zur Tetraspanin-Superfamilie gehört [2]. Dieses Protein wird in einer Vielzahl von hämatopoetischen und nichthämatopoetischen Zellen exprimiert.
• CD9 ist an Zellwachstum, Zelladhäsion, Zellmotilität, Membranfusion, Virusinfektion und Metastasierung von Tumorzellen beteiligt [2–4]. Nervensysteme, einschließlich sympathischer Neuronen und Spinalganglienzellen, exprimieren CD9 [5].
• Auch Schwann-Zellen und Gliazellen des ZNS exprimieren CD9 [6]. Myelin im ZNS und im peripheren Nervensystem enthält reichlich CD9 [7, 8].
• Obwohl die Funktion von CD9 im Myelin noch nicht aufgeklärt wurde, legt die reichliche Expression von CD9 nahe, dass das Glykoprotein eine einzigartige Funktion an der Oberfläche von Myelin hat.
• Autoimmunreaktionen auf Myelinproteine ​​gelten als mögliche Ursachen für den Beginn und das Fortschreiten einiger demyelinisierender Erkrankungen [9].
• Dies veranlasste uns zu untersuchen, ob CD9 auch an demyelinisierenden Erkrankungen und anderen neurologischen Störungen beteiligt sein könnte.
• In dieser Studie untersuchten wir die Konzentrationen von Anti-CD9-Antikörpern in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) bei Patienten mit neurologischen Erkrankungen.

Patienten, Materialien und Methoden

Patienten und Liquorproben. SSPE wurde auf der Grundlage klinischer Merkmale diagnostiziert und durch das Vorhandensein charakteristischer elektroenzephalographischer Befunde und Masern-Antikörperspiegel im Liquor bestätigt. Das klinische Staging basierte auf den Methoden von Jabbour et al. [10]. Diagnosen anderer Krankheiten basierten auf relevanten Kriterien. CSF-Proben wurden durch Lumbalpunktion von Patienten mit neurologischen Störungen erhalten, darunter 12 Patienten mit SSPE (9 Männer und 3 Frauen). Wir bestimmten auch CSF-Spiegel von Anti-CD9-Antikörpern bei 5 Patienten mit orthopädischen Erkrankungen und 3 Patienten mit gynäkologischen Erkrankungen (Kontrollpersonen).

Glutathion-S-Transferase (GST)-CD9-Proteine. Die rekombinanten GST-Fusionsproteine, die die zweite extrazelluläre Schleife von CD9 enthalten, die AS 113–194 von entweder Affen-CD9 (mkCD9) oder menschlichem CD9 (hCD9) entspricht, wurden in Escherichia coli mit pGEX-3X-Plasmiden (Pharmacia) inseriert produziert entsprechende cDNA-Sequenzen von CD9 an EcoRI/BamHI-Stellen. Diese Formen von GST-Fusionsproteinen, die als „GST-mkCD9“ und „GST-hCD9“ bezeichnet werden, decken den größten Teil der extrazellulären Domäne von CD9 ab und werden von mehreren monoklonalen Maus-Antikörpern (MAbs) erkannt, die mittels Immunpräzipitation und Western gegen hCD9 gerichtet sind beflecken. Das GST-Fusionsprotein, das humanen Heparin-bindenden epidermalen Wachstumsfaktor-ähnlichen Wachstumsfaktor (GST-HB) enthält, der AS 106–149 entspricht, wurde ebenfalls in E. coli produziert [11]. Fusionsproteine ​​wurden unter Verwendung von 2 Reinigungsschrittzyklen mit Glutathion-Sepharose 4B (Pharmacia) gereinigt, wie in den Protokollen des Herstellers angegeben.

RIA. Wir verwendeten einen Festphasen-RIA, um die Menge an Anti-CD9-Antikörpern im Liquor zu bestimmen. Insgesamt wurden 30 &mgr;g GST-CD9 (GSTmkCD9 oder GST-hCD9) oder GST-Protein auf einer Reacti-Bind-Glutathion-beschichteten Streifen-Well-Platte (Pierce) immobilisiert. Die Platten wurden mit Blockierungslösung (0,15 M NaCl, 50 mM Tris, 1 mg/ml Rinderserumalbumin [BSA] und 1 % Magermilch, pH 8,0) bei 37°C für 3 h und bei 4°C über Nacht inkubiert. CSF von Patienten wurde dreimal mit Blockierungslösung verdünnt, und 50 &mgr;l des verdünnten CSF wurden zu den Vertiefungen der GST-CD9- und GST-beschichteten Platten gegeben. Die Platten wurden 2 h bei 37°C und dann 3 h bei 4°C inkubiert. Nachdem die Wells dreimal mit Waschlösung (50 µM Tris und 0,15 M NaCl, pH 8,0) gewaschen worden waren, wurden die Platten mit 50 µL 125I-markiertem Anti-Human-IgG (schwere und leichte Ketten; 10 µg/mL) inkubiert Blockierungslösung bei 37°C für 2 h. Nach weiteren 3 Waschgängen mit Waschlösung wurde die in jeder Vertiefung verbliebene Radioaktivität mit einem Gammazähler gezählt. Für Bindungsexperimente verwendeten wir sowohl die GST-CD9-beschichtete Platte als auch die GST-beschichtete Platte für jede CSF-Probe. Die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der von der GST-beschichteten Platte erhaltenen unspezifischen Bindung von der von der GST-CD9-beschichteten Platte erhaltenen Gesamtbindung bestimmt. Die Daten werden als die Menge an 125 I-markiertem Anti-Human-IgG ausgedrückt, die aus den Werten der spezifischen Bindung und der spezifischen Aktivität des 125 I-markierten Antikörpers berechnet wurde.

Western-Blotting. GST-Fusionsproteine ​​und GST wurden einer SDS-PAGE unterzogen und auf eine Immobilon-Membran (Millipore) elektrotransferiert, wie an anderer Stelle beschrieben [7]. CSF-Proben wurden dreimal mit Tris-gepufferter Saline-BSA (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl und 3 % BSA, pH 7,5) verdünnt und Membranen wurden bei 4°C über Nacht mit den verdünnten CSF-Proben inkubiert. Nach Inkubation mit 10 ng/ml Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Human-IgG wurden immunreagierte Banden mit einem ECL-Western-Blotting-Kit (Amersham International) sichtbar gemacht. Maus-Anti-hCD9-MAb (Klon KazR-1) und HRP-konjugiertes Anti-Maus-IgG wurden ebenfalls als Kontrollen verwendet.