amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Abstrakt
Sondenbasierte quantitative PCR (qPCR) ist eine bevorzugte Methode zur Messung der Transkripthäufigkeit, da sie eine der empfindlichsten Nachweismethoden ist, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Die sondenbasierte Chemie bietet im Vergleich zu anderen (farbstoffbasierten) Chemien die geringste Hintergrundfluoreszenz.

Derzeit sind mehrere Plattformen verfügbar, die auf Sonden basierende Chemie verwenden, um die Transkripthäufigkeit zu quantifizieren.

qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemäßig am häufigsten verwendete Methode, es können jedoch nur maximal 96 Proben oder miRNAs in einem einzigen Lauf getestet werden. Dies ist zeitaufwändig und langwierig, wenn eine große Anzahl von Proben/miRNAs analysiert werden soll. Sondenbasierte Plattformen mit hohem Durchsatz wie Mikrofluidik (z. B. TaqMan Array Card) und Nanofluidik-Arrays (z. B. OpenArray) bieten eine einfache Möglichkeit, die Fülle mehrerer microRNAs in einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit reproduzierbar und effizient nachzuweisen. Hier demonstrieren wir den experimentellen Aufbau und das Protokoll für die miRNA-Quantifizierung aus Serum- oder Plasma-EDTA-Proben unter Verwendung von sondenbasierter Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik- und Nanofluidik-Arrays), die einen steigenden Durchsatz bieten.

Einführung

MicroRNAs (miRNAs) sind ~22 Nukleotide nichtkodierende (nc)RNAs, die als Regulatoren der Genexpression fungieren1-3. Die meisten miRNAs in Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, die auf die 3′-UTR abzielt, was zu einer negativen Regulation der Genexpression führt2-4.

Dies geschieht normalerweise durch Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomalen Drop-off. Im Umlauf befindliche miRNAs haben sich in der Forschung und im klinischen Bereich als neuartige Biomarker für eine Vielzahl von Krankheiten wie Diabetes5-7, Eierstock8, Prostata9 und Brustkrebs10,11, Hepatitis B12 und andere Autoimmunerkrankungen13 erwiesen. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich vorhandene miRNAs in verschiedenen Zellen oder Geweben sowie im Kreislauf von menschlichen Plasma- und Serumproben zu identifizieren, was leichter zugänglich und weniger invasiv ist9,11-15.

Verschiedene Methoden der miRNA-Quantifizierung wurden unter Verwendung mehrerer Plattformen etabliert, wie z. B.

der Standard-96-Well-Plattenplattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik-Kartenplattform12,18-23 und der Nanofluidik-Array-Plattform17,24. Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, die relative oder absolute Anzahl von Transkripten unter Verwendung mehrerer (farbstoff- oder sondenbasierter) Chemien zu messen.

  • Sondenbasierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil einer geringen Hintergrundfluoreszenz und einer hohen Empfindlichkeit zum Nachweis einer einzelnen Transkriptkopie.
  • Es ist relativ kostengünstig, einfach zu verwenden und hochgradig reproduzierbar, was es zu einer bevorzugten Methode zur Quantifizierung und Bestimmung der miRNA-Expression macht25. Die sondenbasierte qPCR-Methode umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: Reverse Transkription (RT) und qPCR4,26,27.
  • Bei RT wird der Stem-Loop-RT-Primer mit einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und in komplementäre (c)DNA umgewandelt. Die Quantifizierung des cDNA-Produkts erfolgt dann unter Verwendung von miRNA-spezifischen PCR-Primern26-28. Das Prinzip der Sonden-basierten qPCR basiert auf dem Nachweis der komplementären Strangverlängerung in Echtzeit, was eine Hydrolyse der fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet.
  • Diese Sonden sind so konzipiert, dass sie einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher enthalten, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu ermöglichen. Die Detektion der Emission des Fluoreszenzreporters (Emitters) wird durch die unmittelbare Nähe des Quencher-Moleküls maskiert.
  • Wenn sich die Taq-Polymerase (pol) vom stromaufwärts gelegenen Primer aus erstreckt und eine Gabelung (das 5′-Ende der Sonde) erreicht, hydrolysiert die Aktivität der Taq-pol-Exonuklease die Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziation/Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher führt.
  • Diese Freisetzung eines einzelnen Fluoreszenzemittermoleküls wird vom Detektor aufgezeichnet und als inkrementelle Zunahme des Fluoreszenzsignals von dieser Vertiefung/Reaktion dargestellt. Die Zunahme der Fluoreszenz ist proportional zur Menge des erzeugten PCR-Produkts, was eine genaue Quantifizierung des amplifizierten Ziels ermöglicht26,28.

Angesichts der steigenden Nachfrage nach miRNA-Quantifizierung wurden Technologien mit mittlerem bis hohem Durchsatz entwickelt, um die Verarbeitung einer größeren Anzahl von Proben in kurzer Zeit zu ermöglichen. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein innovatives mikrofluidisches Design mit mittlerem Durchsatz, das auf sondenbasierter qPCR-Chemie basiert und eine Erhöhung der Anzahl der auf einer Platte analysierten miRNAs ermöglicht. TLDA beinhaltet die Verwendung eines vordefinierten Pools von RT-Primern, die zur Synthese der cDNA verwendet werden. Diese cDNAs werden dann in eine kundenspezifische mikrofluidische Karte mit 384 Vertiefungen gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mithilfe von qPCR22,26,29 zu bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrocknete Primer und Sonden zur Amplifikation spezifischer miRNA(s), daher können bis zu 384 Reaktionen in einer einzigen TLDA-Karte verarbeitet werden26.

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-001 GenDepot 1ml 174 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

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Q5701-050 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

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Q5700-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

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Q5702-050 GenDepot 50x1ml 334 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

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Q5703-003 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

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Q5703-005 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

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P7000-010 GenDepot 10x1 ml 317 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-050 GenDepot 50x1 ml 1211 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-100 GenDepot 100x1 ml 2102 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-001 GenDepot 1ml 146 EUR

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Q5602-001 GenDepot 1ml 146 EUR

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amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-001 GenDepot 1ml 280 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-002 GenDepot 2x1ml 482 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-005 GenDepot 5x1ml 828 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-010 GenDepot 10x1ml 1360 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-010 GenDepot 2x50 rxns 126 EUR

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P0311-025 GenDepot 5X50 rxns 165 EUR

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amfiSure Prime PCR Master Mix

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P1311-050 GenDepot 10X50 rxns 219 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-125 GenDepot 15X50 rxns 273 EUR

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P1311-500 GenDepot 100x50 rxns 1238 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-025 GenDepot 5X50 rxns 165 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-050 GenDepot 10X50 rxns 223 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-125 GenDepot 15X50 rxns 282 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-250 GenDepot 50x50 rxns 752 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-500 GenDepot 100x50 rxns 1279 EUR

HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

BS9291 Bio Basic 5X1mL, 5ml 209.5 EUR

HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

BS9292 Bio Basic 1ml 96.4 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

BS9295 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

BS9296 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

BS9297 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

BS9298 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 253 EUR

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P0342-025 GenDepot 5X50 rxns 455 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-050 GenDepot 10X50 rxns 779 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-100 GenDepot 20x50 rxns 1333 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-010 GenDepot 2X50 rxns 151 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-025 GenDepot 5X50 rxns 273 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-050 GenDepot 10X50 rxns 448 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-250 GenDepot 50x50 rxns 1873 EUR

Pfu 2x Master Mix - 200 Reactions

3326 Intact Genomics 1/EA 300 EUR

Gloria Nova HS 2x Master Mix

RK20717 Abclonal 1mL Ask for price

Entrans 2X qPCR Probe Master Mix

RK21208 Abclonal 40 RXN Ask for price

2x SYBR Green qPCR Master Mix

B21202 Bimake 5 mL 224 EUR

2x SYBR Green qPCR Master Mix

B21203 Bimake 25 mL 856 EUR

2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn)

T403 101Bio - Ask for price

PCR-EZ D-PCR MASTER MIX

BS294 Bio Basic 100RXN, 100prep 93.5 EUR

MyTaq Blood PCR Mix, 2x

BIO-25053/S Bioline Sample Ask for price

MyTaq Blood PCR Mix, 2x

BIO-25054 Bioline 250 Reactions Ask for price

2x GoldStar Best PCR Master Mix (with Dyes), 20 ul/rxn

W0655-1 101Bio - Ask for price

2x GoldStar Best PCR Master Mix (with Dyes), 20 ul/rxn

W0655-5 101Bio - Ask for price

amfiEco PCR Master Mix,8-Strip RTU(2X), for 50ul reaction

P0704-096 GenDepot 96 rxns 145 EUR

Hot Start Taq 2x Master Mix - 500 Reactions

3296 Intact Genomics 1/EA 268 EUR

Das Nanofluidik-Array ist eine Hochdurchsatzplattform, die zum Nachweis von Gentranskripten24 unter Verwendung der gleichen Sonden-basierten Chemie verwendet wird. Es verwendet eine proprietäre Matrix, die hydrophob-hydrophile Wechselwirkungen bietet, um das einfache Laden der 33-Nanliter-Reaktionsmischung in eine Reihe von 3072-Durchgangslöchern auf einem Objektträger aus rostfreiem Stahl24 zu erleichtern. Dieser Artikel konzentriert sich darauf zu zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs in Serum/Plasma durchgeführt werden und welche kritischen Faktoren bei der Durchführung und Interpretation solcher Daten berücksichtigt werden müssen. Unter Berücksichtigung werden ihre individuellen Vorteile und Einschränkungen in diesem Artikel diskutiert.

 

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