amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Abstrakt
Sondenbasierte quantitative PCR (qPCR) ist eine bevorzugte Methode zur Messung der Transkripthäufigkeit, da sie eine der empfindlichsten Nachweismethoden ist, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Die sondenbasierte Chemie bietet im Vergleich zu anderen (farbstoffbasierten) Chemien die geringste Hintergrundfluoreszenz.

Derzeit sind mehrere Plattformen verfügbar, die auf Sonden basierende Chemie verwenden, um die Transkripthäufigkeit zu quantifizieren.

qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemäßig am häufigsten verwendete Methode, es können jedoch nur maximal 96 Proben oder miRNAs in einem einzigen Lauf getestet werden. Dies ist zeitaufwändig und langwierig, wenn eine große Anzahl von Proben/miRNAs analysiert werden soll. Sondenbasierte Plattformen mit hohem Durchsatz wie Mikrofluidik (z. B. TaqMan Array Card) und Nanofluidik-Arrays (z. B. OpenArray) bieten eine einfache Möglichkeit, die Fülle mehrerer microRNAs in einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit reproduzierbar und effizient nachzuweisen. Hier demonstrieren wir den experimentellen Aufbau und das Protokoll für die miRNA-Quantifizierung aus Serum- oder Plasma-EDTA-Proben unter Verwendung von sondenbasierter Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik- und Nanofluidik-Arrays), die einen steigenden Durchsatz bieten.

Einführung

MicroRNAs (miRNAs) sind ~22 Nukleotide nichtkodierende (nc)RNAs, die als Regulatoren der Genexpression fungieren1-3. Die meisten miRNAs in Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, die auf die 3′-UTR abzielt, was zu einer negativen Regulation der Genexpression führt2-4.

Dies geschieht normalerweise durch Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomalen Drop-off. Im Umlauf befindliche miRNAs haben sich in der Forschung und im klinischen Bereich als neuartige Biomarker für eine Vielzahl von Krankheiten wie Diabetes5-7, Eierstock8, Prostata9 und Brustkrebs10,11, Hepatitis B12 und andere Autoimmunerkrankungen13 erwiesen. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich vorhandene miRNAs in verschiedenen Zellen oder Geweben sowie im Kreislauf von menschlichen Plasma- und Serumproben zu identifizieren, was leichter zugänglich und weniger invasiv ist9,11-15.

Verschiedene Methoden der miRNA-Quantifizierung wurden unter Verwendung mehrerer Plattformen etabliert, wie z. B.

der Standard-96-Well-Plattenplattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik-Kartenplattform12,18-23 und der Nanofluidik-Array-Plattform17,24. Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, die relative oder absolute Anzahl von Transkripten unter Verwendung mehrerer (farbstoff- oder sondenbasierter) Chemien zu messen.

  • Sondenbasierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil einer geringen Hintergrundfluoreszenz und einer hohen Empfindlichkeit zum Nachweis einer einzelnen Transkriptkopie.
  • Es ist relativ kostengünstig, einfach zu verwenden und hochgradig reproduzierbar, was es zu einer bevorzugten Methode zur Quantifizierung und Bestimmung der miRNA-Expression macht25. Die sondenbasierte qPCR-Methode umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: Reverse Transkription (RT) und qPCR4,26,27.
  • Bei RT wird der Stem-Loop-RT-Primer mit einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und in komplementäre (c)DNA umgewandelt. Die Quantifizierung des cDNA-Produkts erfolgt dann unter Verwendung von miRNA-spezifischen PCR-Primern26-28. Das Prinzip der Sonden-basierten qPCR basiert auf dem Nachweis der komplementären Strangverlängerung in Echtzeit, was eine Hydrolyse der fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet.
  • Diese Sonden sind so konzipiert, dass sie einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher enthalten, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu ermöglichen. Die Detektion der Emission des Fluoreszenzreporters (Emitters) wird durch die unmittelbare Nähe des Quencher-Moleküls maskiert.
  • Wenn sich die Taq-Polymerase (pol) vom stromaufwärts gelegenen Primer aus erstreckt und eine Gabelung (das 5′-Ende der Sonde) erreicht, hydrolysiert die Aktivität der Taq-pol-Exonuklease die Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziation/Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher führt.
  • Diese Freisetzung eines einzelnen Fluoreszenzemittermoleküls wird vom Detektor aufgezeichnet und als inkrementelle Zunahme des Fluoreszenzsignals von dieser Vertiefung/Reaktion dargestellt. Die Zunahme der Fluoreszenz ist proportional zur Menge des erzeugten PCR-Produkts, was eine genaue Quantifizierung des amplifizierten Ziels ermöglicht26,28.

Angesichts der steigenden Nachfrage nach miRNA-Quantifizierung wurden Technologien mit mittlerem bis hohem Durchsatz entwickelt, um die Verarbeitung einer größeren Anzahl von Proben in kurzer Zeit zu ermöglichen. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein innovatives mikrofluidisches Design mit mittlerem Durchsatz, das auf sondenbasierter qPCR-Chemie basiert und eine Erhöhung der Anzahl der auf einer Platte analysierten miRNAs ermöglicht. TLDA beinhaltet die Verwendung eines vordefinierten Pools von RT-Primern, die zur Synthese der cDNA verwendet werden. Diese cDNAs werden dann in eine kundenspezifische mikrofluidische Karte mit 384 Vertiefungen gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mithilfe von qPCR22,26,29 zu bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrocknete Primer und Sonden zur Amplifikation spezifischer miRNA(s), daher können bis zu 384 Reaktionen in einer einzigen TLDA-Karte verarbeitet werden26.

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

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Q5701-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

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Q5701-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

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Q5701-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

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Q5701-050 GenDepot 50x1ml 3462 EUR

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Q5700-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

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Q5703-003 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

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Q5703-004 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

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Q5703-050 GenDepot 50x1ml 1910 EUR

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

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amfiSure PCR Master Mix

P0311-010 GenDepot 2x50 rxns 151.2 EUR

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amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

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Q5601-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

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Q5600-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5600-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

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Q5600-005 GenDepot 5x1ml 322.8 EUR

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Q5600-010 GenDepot 10x1ml 537.6 EUR

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Q5600-050 GenDepot 50x1ml 2085.6 EUR

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye

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amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-025 GenDepot 5X50 rxns 193.2 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-050 GenDepot 10X50 rxns 262.8 EUR

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P1311-125 GenDepot 15X50 rxns 327.6 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

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amfiSure Advanced PCR Master Mix

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amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-050 GenDepot 10X50 rxns 267.6 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-125 GenDepot 15X50 rxns 338.4 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-250 GenDepot 50x50 rxns 902.4 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-500 GenDepot 100x50 rxns 1534.8 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-001 GenDepot 1ml 180 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-005 GenDepot 5x1ml 690 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-010 GenDepot 10x1ml 1230 EUR

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Q6000-050 GenDepot 50ml 3900 EUR

amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox

Q6700-050 GenDepot 50 rxns 195 EUR

amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox

Q6700-100 GenDepot 2X50 rxns 335 EUR

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Q6700-200 GenDepot 4x50 rxns 580 EUR

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Q6703-100 GenDepot 2X50 rxns 335 EUR

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Q6703-500 GenDepot 10X50 rxns 1060 EUR

amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Fluorescein

Q6701-050 GenDepot 50 rxns 195 EUR

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Q6701-100 GenDepot 2X50 rxns 335 EUR

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amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 303.6 EUR

Das Nanofluidik-Array ist eine Hochdurchsatzplattform, die zum Nachweis von Gentranskripten24 unter Verwendung der gleichen Sonden-basierten Chemie verwendet wird. Es verwendet eine proprietäre Matrix, die hydrophob-hydrophile Wechselwirkungen bietet, um das einfache Laden der 33-Nanliter-Reaktionsmischung in eine Reihe von 3072-Durchgangslöchern auf einem Objektträger aus rostfreiem Stahl24 zu erleichtern. Dieser Artikel konzentriert sich darauf zu zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs in Serum/Plasma durchgeführt werden und welche kritischen Faktoren bei der Durchführung und Interpretation solcher Daten berücksichtigt werden müssen. Unter Berücksichtigung werden ihre individuellen Vorteile und Einschränkungen in diesem Artikel diskutiert.

 

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