Abstrakt
Sondenbasierte quantitative PCR (qPCR) ist eine bevorzugte Methode zur Messung der Transkripthäufigkeit, da sie eine der empfindlichsten Nachweismethoden ist, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Die sondenbasierte Chemie bietet im Vergleich zu anderen (farbstoffbasierten) Chemien die geringste Hintergrundfluoreszenz.
Derzeit sind mehrere Plattformen verfügbar, die auf Sonden basierende Chemie verwenden, um die Transkripthäufigkeit zu quantifizieren.
qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemäßig am häufigsten verwendete Methode, es können jedoch nur maximal 96 Proben oder miRNAs in einem einzigen Lauf getestet werden. Dies ist zeitaufwändig und langwierig, wenn eine große Anzahl von Proben/miRNAs analysiert werden soll. Sondenbasierte Plattformen mit hohem Durchsatz wie Mikrofluidik (z. B. TaqMan Array Card) und Nanofluidik-Arrays (z. B. OpenArray) bieten eine einfache Möglichkeit, die Fülle mehrerer microRNAs in einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit reproduzierbar und effizient nachzuweisen. Hier demonstrieren wir den experimentellen Aufbau und das Protokoll für die miRNA-Quantifizierung aus Serum- oder Plasma-EDTA-Proben unter Verwendung von sondenbasierter Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik- und Nanofluidik-Arrays), die einen steigenden Durchsatz bieten.
Einführung
MicroRNAs (miRNAs) sind ~22 Nukleotide nichtkodierende (nc)RNAs, die als Regulatoren der Genexpression fungieren1-3. Die meisten miRNAs in Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, die auf die 3′-UTR abzielt, was zu einer negativen Regulation der Genexpression führt2-4.
Dies geschieht normalerweise durch Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomalen Drop-off. Im Umlauf befindliche miRNAs haben sich in der Forschung und im klinischen Bereich als neuartige Biomarker für eine Vielzahl von Krankheiten wie Diabetes5-7, Eierstock8, Prostata9 und Brustkrebs10,11, Hepatitis B12 und andere Autoimmunerkrankungen13 erwiesen. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich vorhandene miRNAs in verschiedenen Zellen oder Geweben sowie im Kreislauf von menschlichen Plasma- und Serumproben zu identifizieren, was leichter zugänglich und weniger invasiv ist9,11-15.
Verschiedene Methoden der miRNA-Quantifizierung wurden unter Verwendung mehrerer Plattformen etabliert, wie z. B.
der Standard-96-Well-Plattenplattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik-Kartenplattform12,18-23 und der Nanofluidik-Array-Plattform17,24. Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, die relative oder absolute Anzahl von Transkripten unter Verwendung mehrerer (farbstoff- oder sondenbasierter) Chemien zu messen.
- Sondenbasierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil einer geringen Hintergrundfluoreszenz und einer hohen Empfindlichkeit zum Nachweis einer einzelnen Transkriptkopie.
- Es ist relativ kostengünstig, einfach zu verwenden und hochgradig reproduzierbar, was es zu einer bevorzugten Methode zur Quantifizierung und Bestimmung der miRNA-Expression macht25. Die sondenbasierte qPCR-Methode umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: Reverse Transkription (RT) und qPCR4,26,27.
- Bei RT wird der Stem-Loop-RT-Primer mit einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und in komplementäre (c)DNA umgewandelt. Die Quantifizierung des cDNA-Produkts erfolgt dann unter Verwendung von miRNA-spezifischen PCR-Primern26-28. Das Prinzip der Sonden-basierten qPCR basiert auf dem Nachweis der komplementären Strangverlängerung in Echtzeit, was eine Hydrolyse der fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet.
- Diese Sonden sind so konzipiert, dass sie einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher enthalten, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu ermöglichen. Die Detektion der Emission des Fluoreszenzreporters (Emitters) wird durch die unmittelbare Nähe des Quencher-Moleküls maskiert.
- Wenn sich die Taq-Polymerase (pol) vom stromaufwärts gelegenen Primer aus erstreckt und eine Gabelung (das 5′-Ende der Sonde) erreicht, hydrolysiert die Aktivität der Taq-pol-Exonuklease die Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziation/Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher führt.
- Diese Freisetzung eines einzelnen Fluoreszenzemittermoleküls wird vom Detektor aufgezeichnet und als inkrementelle Zunahme des Fluoreszenzsignals von dieser Vertiefung/Reaktion dargestellt. Die Zunahme der Fluoreszenz ist proportional zur Menge des erzeugten PCR-Produkts, was eine genaue Quantifizierung des amplifizierten Ziels ermöglicht26,28.
Angesichts der steigenden Nachfrage nach miRNA-Quantifizierung wurden Technologien mit mittlerem bis hohem Durchsatz entwickelt, um die Verarbeitung einer größeren Anzahl von Proben in kurzer Zeit zu ermöglichen. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein innovatives mikrofluidisches Design mit mittlerem Durchsatz, das auf sondenbasierter qPCR-Chemie basiert und eine Erhöhung der Anzahl der auf einer Platte analysierten miRNAs ermöglicht. TLDA beinhaltet die Verwendung eines vordefinierten Pools von RT-Primern, die zur Synthese der cDNA verwendet werden. Diese cDNAs werden dann in eine kundenspezifische mikrofluidische Karte mit 384 Vertiefungen gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mithilfe von qPCR22,26,29 zu bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrocknete Primer und Sonden zur Amplifikation spezifischer miRNA(s), daher können bis zu 384 Reaktionen in einer einzigen TLDA-Karte verarbeitet werden26.
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5701-001 | GenDepot | 1ml | 208.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5701-002 | GenDepot | 2x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5701-005 | GenDepot | 5x1ml | 562.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5701-010 | GenDepot | 10x1ml | 886.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5701-050 | GenDepot | 50x1ml | 3462 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5700-001 | GenDepot | 1ml | 208.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5700-002 | GenDepot | 2x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5700-005 | GenDepot | 5x1ml | 562.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5700-010 | GenDepot | 10x1ml | 886.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5700-050 | GenDepot | 50x1ml | 3462 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5703-001 | GenDepot | 1ml | 208.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5703-002 | GenDepot | 2x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5703-003 | GenDepot | 5x1ml | 562.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5703-004 | GenDepot | 10x1ml | 886.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5703-005 | GenDepot | 50x1ml | 3462 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5702-001 | GenDepot | 1ml | 208.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5702-002 | GenDepot | 2x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5702-005 | GenDepot | 5x1ml | 562.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5702-010 | GenDepot | 10x1ml | 886.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5702-050 | GenDepot | 50x1ml | 400.8 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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P7000-005 | GenDepot | 5x1 ml | 262.8 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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P7000-010 | GenDepot | 10x1 ml | 380.4 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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P7000-050 | GenDepot | 50x1 ml | 1453.2 EUR |
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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P7000-100 | GenDepot | 100x1 ml | 2522.4 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-010 | GenDepot | 2x50 rxns | 151.2 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 198 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 262.8 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-100 | GenDepot | 10x1ml | 343.2 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-125 | GenDepot | 15X50 rxns | 333.6 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-200 | GenDepot | 20x1ml | 562.8 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-250 | GenDepot | 50x50 rxns | 902.4 EUR |
amfiSure PCR Master Mix |
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P0311-500 | GenDepot | 100x50 rxns | 1509.6 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0346-001 | GenDepot | 1ml | 336 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0346-002 | GenDepot | 2x1ml | 578.4 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0346-005 | GenDepot | 5x1ml | 993.6 EUR |
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0346-010 | GenDepot | 10x1ml | 1632 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5601-001 | GenDepot | 1ml | 175.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5601-002 | GenDepot | 2x1ml | 248.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5601-005 | GenDepot | 5x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5601-010 | GenDepot | 10x1ml | 530.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein |
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Q5601-050 | GenDepot | 50x1ml | 2004 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5600-001 | GenDepot | 1ml | 175.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5600-002 | GenDepot | 2x1ml | 248.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5600-005 | GenDepot | 5x1ml | 322.8 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5600-010 | GenDepot | 10x1ml | 537.6 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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Q5600-050 | GenDepot | 50x1ml | 2085.6 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5603-001 | GenDepot | 1ml | 175.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5603-002 | GenDepot | 2x1ml | 248.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5603-005 | GenDepot | 5x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5603-010 | GenDepot | 10x1ml | 530.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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Q5603-050 | GenDepot | 50x1ml | 2004 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5602-001 | GenDepot | 1ml | 175.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5602-002 | GenDepot | 2x1ml | 248.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5602-005 | GenDepot | 5x1ml | 319.2 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5602-010 | GenDepot | 10x1ml | 530.4 EUR |
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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Q5602-050 | GenDepot | 50x1ml | 2004 EUR |
amfiSure Prime PCR Master Mix |
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P1311-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 193.2 EUR |
amfiSure Prime PCR Master Mix |
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P1311-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 262.8 EUR |
amfiSure Prime PCR Master Mix |
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P1311-125 | GenDepot | 15X50 rxns | 327.6 EUR |
amfiSure Prime PCR Master Mix |
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P1311-250 | GenDepot | 50x50 rxns | 886.8 EUR |
amfiSure Prime PCR Master Mix |
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P1311-500 | GenDepot | 100x50 rxns | 1485.6 EUR |
amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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P2311-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 198 EUR |
amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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P2311-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 267.6 EUR |
amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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P2311-125 | GenDepot | 15X50 rxns | 338.4 EUR |
amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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P2311-250 | GenDepot | 50x50 rxns | 902.4 EUR |
amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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P2311-500 | GenDepot | 100x50 rxns | 1534.8 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0342-010 | GenDepot | 2x50 rxns | 303.6 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0342-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 546 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0342-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 934.8 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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P0342-100 | GenDepot | 20x50 rxns | 1599.6 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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P0331-010 | GenDepot | 2X50 rxns | 181.2 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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P0331-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 327.6 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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P0331-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 537.6 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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P0331-250 | GenDepot | 50x50 rxns | 2247.6 EUR |
amfiEco PCR Master Mix,8-Strip RTU(2X), for 50ul reaction |
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P0704-096 | GenDepot | 96 rxns | 174 EUR |
Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye) |
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BS9297 | Bio Basic | 1ml | 101.76 EUR |
Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye) |
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BS9298 | Bio Basic | 5ml | 227.04 EUR |
Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye) |
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BS9295 | Bio Basic | 1ml | 101.76 EUR |
Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye) |
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BS9296 | Bio Basic | 5ml | 227.04 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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BS9291 | Bio Basic | 5X1mL, 5ml | 251.4 EUR |
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye) |
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BS9292 | Bio Basic | 1ml | 115.68 EUR |
amfiSure LQ Long PCR Polymerase |
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P0326-010 | GenDepot | 100 units | 230.4 EUR |
amfiSure LQ Long PCR Polymerase |
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P0326-025 | GenDepot | 250 units | 400.8 EUR |
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer |
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D0300-010 | GenDepot | 100ml | 165.6 EUR |
2x Genotyping PCR Ready Master Mix (250 x 20µL rxn) |
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T403 | 101Bio | - | Ask for price |
amfiSure PCR Premix, Custom Order, Without Primer |
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P0319-960 | GenDepot | 10X96 rxns | 2587.2 EUR |
amfiSure PCR Premix, Custom Order, Including Primer |
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P0318-960 | GenDepot | 10X96 rxns | 2587.2 EUR |
PCR-EZ D-PCR MASTER MIX |
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BS294 | Bio Basic | 100RXN, 100prep | 112.2 EUR |
2x GoldStar Best PCR Master Mix (with Dyes), 20 ul/rxn |
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W0655-1 | 101Bio | - | Ask for price |
2x GoldStar Best PCR Master Mix (with Dyes), 20 ul/rxn |
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W0655-5 | 101Bio | - | Ask for price |
Pfu 2x Master Mix - 200 Reactions |
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3326 | Intact Genomics | 1/EA | 360 EUR |
amfiRivert cDNA Synthesis Master Mix |
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R5101-050 | GenDepot | 50 rxns | 498 EUR |
Das Nanofluidik-Array ist eine Hochdurchsatzplattform, die zum Nachweis von Gentranskripten24 unter Verwendung der gleichen Sonden-basierten Chemie verwendet wird. Es verwendet eine proprietäre Matrix, die hydrophob-hydrophile Wechselwirkungen bietet, um das einfache Laden der 33-Nanliter-Reaktionsmischung in eine Reihe von 3072-Durchgangslöchern auf einem Objektträger aus rostfreiem Stahl24 zu erleichtern. Dieser Artikel konzentriert sich darauf zu zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs in Serum/Plasma durchgeführt werden und welche kritischen Faktoren bei der Durchführung und Interpretation solcher Daten berücksichtigt werden müssen. Unter Berücksichtigung werden ihre individuellen Vorteile und Einschränkungen in diesem Artikel diskutiert.