Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine der leistungsstärksten Technologien in der Molekularbiologie. Mithilfe von PCR können spezifische Sequenzen innerhalb einer DNA- oder komplementären DNA (cDNA)-Matrize kopiert oder viele tausend- bis millionenfach „amplifiziert“ werden, indem sequenzspezifische Oligonukleotide, hitzestabile DNA-Polymerase, und thermisches Radfahren. Bei der traditionellen (Endpunkt-)PCR erfolgen der Nachweis und die Quantifizierung der amplifizierten Sequenz am Ende der Reaktion nach dem letzten PCR-Zyklus und beinhalten Post-PCR-Analysen wie Gelelektrophorese und Bildanalyse.
Bei der quantitativen Real-Time-PCR (oft abgekürzt Real-Time-PCR bzw qPCR), wird das PCR-Produkt bei jedem Zyklus gemessen. Durch Überwachung der Reaktionen während der exponentiellen Amplifikationsphase der Reaktion können Benutzer die anfängliche Menge des Ziels mit großer Präzision bestimmen.
PCR amplifiziert DNA theoretisch exponentiell, wodurch die Anzahl der Zielmoleküle mit jedem Amplifikationszyklus verdoppelt wird.
Als es erstmals entwickelt wurde, argumentierten die Wissenschaftler, dass die Anzahl der Zyklen und die Menge des PCR-Endprodukts verwendet werden könnten, um die anfängliche Menge an genetischem Material durch Vergleich mit einem bekannten Standard zu berechnen. Um der Notwendigkeit einer robusten Quantifizierung gerecht zu werden, wurde die Technik der Echtzeit-PCR entwickelt. Gegenwärtig wird die Endpunkt-PCR hauptsächlich verwendet, um spezifische DNA für die Sequenzierung, Klonierung und Verwendung in anderen molekularbiologischen Techniken zu amplifizieren.
- Bei der Echtzeit-PCR wird die DNA-Menge nach jedem Zyklus über fluoreszierende Farbstoffe gemessen, die ein zunehmendes Fluoreszenzsignal liefern, das direkt proportional zur Anzahl der erzeugten PCR-Produktmoleküle (Amplikons) ist. Daten, die in der exponentiellen Phase der Reaktion gesammelt werden, liefern quantitative Informationen über die Ausgangsmenge des Amplifikationsziels.
- Fluoreszierende Reporter, die in der Echtzeit-PCR verwendet werden, umfassen doppelsträngige DNA (dsDNA)-bindende Farbstoffe oder Farbstoffmoleküle, die an PCR-Primer oder Sonden gebunden sind, die während der Amplifikation mit PCR-Produkten hybridisieren.
- Die Änderung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion wird durch ein Instrument gemessen, das thermische Zyklen mit der Fähigkeit zum Scannen von Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert. Durch Auftragen der Fluoreszenz gegen die Zyklusnummer erstellt das Echtzeit-PCR-Instrument ein Amplifikationsdiagramm, das die Akkumulation des Produkts über die Dauer der gesamten PCR darstellt.
Zu den Vorteilen der Echtzeit-PCR gehören:
• Möglichkeit, den Fortschritt einzelner PCR-Reaktionen in Echtzeit zu überwachen
• Fähigkeit, die Menge an Amplikons bei jedem Zyklus genau zu messen, was eine hochgenaue Quantifizierung der Menge an Ausgangsmaterial in Proben ermöglicht
• Ein erhöhter dynamischer Erfassungsbereich
• Amplifikation und Detektion erfolgen in einem einzigen Röhrchen, wodurch Post-PCR-Manipulationen entfallen
In den letzten Jahren hat sich die Echtzeit-PCR zum führenden Werkzeug für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA oder RNA entwickelt. Die Verwendung dieser Techniken ermöglicht eine präzise Erkennung, die innerhalb eines 2-fachen Bereichs genau ist, wobei der dynamische Bereich des Eingangsmaterials 6 bis 8 Größenordnungen abdeckt.
Überblick über real-time PCR
Dieser Abschnitt gibt einen Überblick über die erforderlichen Schritte bei der Durchführung von Echtzeit-PCR. Real-Time-PCR ist eine Variante der allgemein verwendeten Standard-PCR-Technik um DNA oder RNA in einer Probe zu quantifizieren. Mithilfe sequenzspezifischer Primer wird die Anzahl der Kopien einer bestimmten DNA ermittelt oder RNA-Sequenz bestimmt werden. Durch die Messung der Menge des amplifizierten Produkts in jeder Stufe während der PCR Zyklus ist eine Quantifizierung möglich. Wenn eine bestimmte Sequenz (DNA oder RNA) in der Probe reichlich vorhanden ist, Amplifikation wird in früheren Zyklen beobachtet; wenn die Folge knapp ist, Amplifikation wird in späteren Zyklen beobachtet. Quantifizierung von
amplifiziertes Produkt wird unter Verwendung von fluoreszierenden Sonden erhalten oder fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe und Echtzeit-PCRInstrumente, die die Fluoreszenz während der Durchführung messen die thermische Zyklierung für PCR.
Echtzeit-PCR-Schritte
Jeder Zyklus besteht aus drei Hauptschritten
Echtzeit-PCR. Reaktionen werden im Allgemeinen für 40 Zyklen durchgeführt.
1. Denaturierung – Hochtemperaturinkubation wird verwendet dsDNA in Einzelstränge „schmelzen“ und sekundär lösen Struktur in einzelsträngiger DNA (ssDNA). Das höchste Temperatur, der die DNA-Polymerase widerstehen kann, ist typischerweise verwendet (normalerweise 95°C). Die Denaturierungszeit kann
erhöht werden, wenn der Templat-GC-Gehalt hoch ist.
2. Glühen – während des Glühens ergänzend Sequenzen haben die Möglichkeit zu hybridisieren, so an
geeignete Temperatur verwendet wird, die auf der basiert berechnete Schmelztemperatur (Tm) der Primer
(typischerweise 5°C unter der Tm der Grundierung).
3. Verlängerung – bei 70–72°C die Aktivität der DNA Polymerase ist optimal, und es findet eine Primerverlängerung statt mit Raten von bis zu 100 Basen pro Sekunde. Wenn ein Amplikon in Echtzeit-PCR ist klein, dieser Schritt ist oft kombiniert mit dem Temperschritt unter Verwendung von 60°C als
die Temperatur.
Zweistufige qRT-PCR
Die zweistufige quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRTPCR) beginnt mit der reversen Transkription von beiden Gesamt-RNA oder Poly(A)-RNA in cDNA unter Verwendung einer Umkehrung Transkriptase. Diese Erststrang-cDNA-Synthesereaktion kann unter Verwendung von zufälligen Primern, Oligo(dT) oder genspezifischen Primern geprimt werden. Alle gleichermaßen vertreten Targets in Echtzeit-PCR-Anwendungen und zur Vermeidung des 3’Bias von Oligo(dT)-Primern verwenden viele Forscher zufällig Primer oder eine Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Primern. Die für die cDNA-Synthese verwendete Temperatur hängt von der ab reverse Transkriptase gewählt. Nach der umgekehrten Transkription etwa 10 % der cDNA werden auf a übertragen separates Röhrchen für die Echtzeit-PCR.
amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure PCR Master Mix |
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amfiSure Prime PCR Master Mix |
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amfiSure Prime PCR Master Mix |
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amfiSure Prime PCR Master Mix |
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amfiSure Prime PCR Master Mix |
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amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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amfiSure Advanced PCR Master Mix |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X) |
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amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye |
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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5702-010 | GenDepot | 10x1ml | 886.8 EUR |
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox |
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| Q5702-050 | GenDepot | 50x1ml | 400.8 EUR |
amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X) |
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amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X) |
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| Q6000-005 | GenDepot | 5x1ml | 690 EUR |
amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X) |
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| Q6000-010 | GenDepot | 10x1ml | 1230 EUR |
amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X) |
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| Q6000-050 | GenDepot | 50ml | 3900 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox |
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| Q6700-050 | GenDepot | 50 rxns | 195 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox |
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amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox |
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| Q6700-200 | GenDepot | 4x50 rxns | 580 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox |
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| Q6700-500 | GenDepot | 10X50 rxns | 1060 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Low Rox |
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| Q6703-050 | GenDepot | 50 rxns | 195 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Low Rox |
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| Q6703-100 | GenDepot | 2X50 rxns | 335 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Low Rox |
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| Q6703-200 | GenDepot | 4x50 rxns | 580 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Low Rox |
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| Q6703-500 | GenDepot | 10X50 rxns | 1060 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), High Rox |
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| Q6702-050 | GenDepot | 50 rxns | 195 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), High Rox |
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| Q6702-100 | GenDepot | 2X50 rxns | 335 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), High Rox |
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| Q6702-200 | GenDepot | 4x50 rxns | 580 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), High Rox |
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| Q6702-500 | GenDepot | 10X50 rxns | 1060 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Fluorescein |
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| Q6701-050 | GenDepot | 50 rxns | 195 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Fluorescein |
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| Q6701-100 | GenDepot | 2X50 rxns | 335 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Fluorescein |
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| Q6701-200 | GenDepot | 4x50 rxns | 580 EUR |
amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), Fluorescein |
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| Q6701-500 | GenDepot | 10X50 rxns | 1060 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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| P0331-010 | GenDepot | 2X50 rxns | 181.2 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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| P0331-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 327.6 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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| P0331-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 537.6 EUR |
amfiXpand PCR Master Mix |
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| P0331-250 | GenDepot | 50x50 rxns | 2247.6 EUR |
amfiSure ONE PCR Premix |
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| P7001-096 | GenDepot | 96 rxns | 105 EUR |
amfiSure LQ Long PCR Polymerase |
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| P0326-010 | GenDepot | 100 units | 230.4 EUR |
amfiSure LQ Long PCR Polymerase |
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| P0326-025 | GenDepot | 250 units | 400.8 EUR |
amfiSure Direct PCR Lysis Buffer |
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| D0300-010 | GenDepot | 100ml | 165.6 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-010 | GenDepot | 2x50 rxns | 303.6 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-025 | GenDepot | 5X50 rxns | 546 EUR |
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X) |
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| P0342-050 | GenDepot | 10X50 rxns | 934.8 EUR |
Einstufige qRT-PCR Einstufige qRT-PCR kombiniert die Erststrang-cDNASynthesereaktion und Echtzeit-PCR-Reaktion in dergleichen Röhrchen, vereinfacht den Reaktionsaufbau und reduziert die Möglichkeit einer Kontamination. Genspezifische Primer sind erforderlich. Dies liegt an der Verwendung von Oligo(dT) oder Random Primer erzeugen in einem Schritt unspezifische Produkte Verfahren und reduzieren Sie die Menge des gewünschten Produkts.