amfiSure PCR-Master-Mix

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine der leistungsstärksten Technologien in der Molekularbiologie. Mithilfe von PCR können spezifische Sequenzen innerhalb einer DNA- oder komplementären DNA (cDNA)-Matrize kopiert oder viele tausend- bis millionenfach „amplifiziert“ werden, indem sequenzspezifische Oligonukleotide, hitzestabile DNA-Polymerase, und thermisches Radfahren. Bei der traditionellen (Endpunkt-)PCR erfolgen der Nachweis und die Quantifizierung der amplifizierten Sequenz am Ende der Reaktion nach dem letzten PCR-Zyklus und beinhalten Post-PCR-Analysen wie Gelelektrophorese und Bildanalyse.

Bei der quantitativen Real-Time-PCR (oft abgekürzt Real-Time-PCR bzw qPCR), wird das PCR-Produkt bei jedem Zyklus gemessen. Durch Überwachung der Reaktionen während der exponentiellen Amplifikationsphase der Reaktion können Benutzer die anfängliche Menge des Ziels mit großer Präzision bestimmen.

PCR amplifiziert DNA theoretisch exponentiell, wodurch die Anzahl der Zielmoleküle mit jedem Amplifikationszyklus verdoppelt wird.

Als es erstmals entwickelt wurde, argumentierten die Wissenschaftler, dass die Anzahl der Zyklen und die Menge des PCR-Endprodukts verwendet werden könnten, um die anfängliche Menge an genetischem Material durch Vergleich mit einem bekannten Standard zu berechnen. Um der Notwendigkeit einer robusten Quantifizierung gerecht zu werden, wurde die Technik der Echtzeit-PCR entwickelt. Gegenwärtig wird die Endpunkt-PCR hauptsächlich verwendet, um spezifische DNA für die Sequenzierung, Klonierung und Verwendung in anderen molekularbiologischen Techniken zu amplifizieren.

  • Bei der Echtzeit-PCR wird die DNA-Menge nach jedem Zyklus über fluoreszierende Farbstoffe gemessen, die ein zunehmendes Fluoreszenzsignal liefern, das direkt proportional zur Anzahl der erzeugten PCR-Produktmoleküle (Amplikons) ist. Daten, die in der exponentiellen Phase der Reaktion gesammelt werden, liefern quantitative Informationen über die Ausgangsmenge des Amplifikationsziels.
  • Fluoreszierende Reporter, die in der Echtzeit-PCR verwendet werden, umfassen doppelsträngige DNA (dsDNA)-bindende Farbstoffe oder Farbstoffmoleküle, die an PCR-Primer oder Sonden gebunden sind, die während der Amplifikation mit PCR-Produkten hybridisieren.
  • Die Änderung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion wird durch ein Instrument gemessen, das thermische Zyklen mit der Fähigkeit zum Scannen von Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert. Durch Auftragen der Fluoreszenz gegen die Zyklusnummer erstellt das Echtzeit-PCR-Instrument ein Amplifikationsdiagramm, das die Akkumulation des Produkts über die Dauer der gesamten PCR darstellt.

Zu den Vorteilen der Echtzeit-PCR gehören:

• Möglichkeit, den Fortschritt einzelner PCR-Reaktionen in Echtzeit zu überwachen
• Fähigkeit, die Menge an Amplikons bei jedem Zyklus genau zu messen, was eine hochgenaue Quantifizierung der Menge an Ausgangsmaterial in Proben ermöglicht
• Ein erhöhter dynamischer Erfassungsbereich
• Amplifikation und Detektion erfolgen in einem einzigen Röhrchen, wodurch Post-PCR-Manipulationen entfallen
In den letzten Jahren hat sich die Echtzeit-PCR zum führenden Werkzeug für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA oder RNA entwickelt. Die Verwendung dieser Techniken ermöglicht eine präzise Erkennung, die innerhalb eines 2-fachen Bereichs genau ist, wobei der dynamische Bereich des Eingangsmaterials 6 bis 8 Größenordnungen abdeckt.

Überblick über real-time PCR

Dieser Abschnitt gibt einen Überblick über die erforderlichen Schritte bei der Durchführung von Echtzeit-PCR. Real-Time-PCR ist eine Variante der allgemein verwendeten Standard-PCR-Technik um DNA oder RNA in einer Probe zu quantifizieren. Mithilfe sequenzspezifischer Primer wird die Anzahl der Kopien einer bestimmten DNA ermittelt oder RNA-Sequenz bestimmt werden. Durch die Messung der Menge des amplifizierten Produkts in jeder Stufe während der PCR Zyklus ist eine Quantifizierung möglich. Wenn eine bestimmte Sequenz (DNA oder RNA) in der Probe reichlich vorhanden ist, Amplifikation wird in früheren Zyklen beobachtet; wenn die Folge knapp ist, Amplifikation wird in späteren Zyklen beobachtet. Quantifizierung von
amplifiziertes Produkt wird unter Verwendung von fluoreszierenden Sonden erhalten oder fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe und Echtzeit-PCRInstrumente, die die Fluoreszenz während der Durchführung messen die thermische Zyklierung für PCR.

Echtzeit-PCR-Schritte

Jeder Zyklus besteht aus drei Hauptschritten
Echtzeit-PCR. Reaktionen werden im Allgemeinen für 40 Zyklen durchgeführt.
1. Denaturierung – Hochtemperaturinkubation wird verwendet dsDNA in Einzelstränge „schmelzen“ und sekundär lösen Struktur in einzelsträngiger DNA (ssDNA). Das höchste Temperatur, der die DNA-Polymerase widerstehen kann, ist typischerweise verwendet (normalerweise 95°C). Die Denaturierungszeit kann
erhöht werden, wenn der Templat-GC-Gehalt hoch ist.
2. Glühen – während des Glühens ergänzend Sequenzen haben die Möglichkeit zu hybridisieren, so an
geeignete Temperatur verwendet wird, die auf der basiert berechnete Schmelztemperatur (Tm) der Primer
(typischerweise 5°C unter der Tm der Grundierung).
3. Verlängerung – bei 70–72°C die Aktivität der DNA Polymerase ist optimal, und es findet eine Primerverlängerung statt mit Raten von bis zu 100 Basen pro Sekunde. Wenn ein Amplikon in Echtzeit-PCR ist klein, dieser Schritt ist oft kombiniert mit dem Temperschritt unter Verwendung von 60°C als
die Temperatur.

Zweistufige qRT-PCR
Die zweistufige quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRTPCR) beginnt mit der reversen Transkription von beiden Gesamt-RNA oder Poly(A)-RNA in cDNA unter Verwendung einer Umkehrung Transkriptase. Diese Erststrang-cDNA-Synthesereaktion kann unter Verwendung von zufälligen Primern, Oligo(dT) oder genspezifischen Primern geprimt werden. Alle gleichermaßen vertreten Targets in Echtzeit-PCR-Anwendungen und zur Vermeidung des 3’Bias von Oligo(dT)-Primern verwenden viele Forscher zufällig Primer oder eine Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Primern. Die für die cDNA-Synthese verwendete Temperatur hängt von der ab reverse Transkriptase gewählt. Nach der umgekehrten Transkription etwa 10 % der cDNA werden auf a übertragen separates Röhrchen für die Echtzeit-PCR.

amfiSure PCR Master Mix

P0311-010 GenDepot 2x50 rxns 126 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-025 GenDepot 5X50 rxns 165 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-050 GenDepot 10X50 rxns 219 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-100 GenDepot 10x1ml 286 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-125 GenDepot 15X50 rxns 278 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-200 GenDepot 20x1ml 469 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-250 GenDepot 50x50 rxns 752 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-500 GenDepot 100x50 rxns 1258 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-025 GenDepot 5X50 rxns 161 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-050 GenDepot 10X50 rxns 219 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-125 GenDepot 15X50 rxns 273 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-500 GenDepot 100x50 rxns 1238 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-025 GenDepot 5X50 rxns 165 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-050 GenDepot 10X50 rxns 223 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-125 GenDepot 15X50 rxns 282 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-250 GenDepot 50x50 rxns 752 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-500 GenDepot 100x50 rxns 1279 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-005 GenDepot 5x1 ml 219 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-010 GenDepot 10x1 ml 317 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-050 GenDepot 50x1 ml 1211 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-100 GenDepot 100x1 ml 2102 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-001 GenDepot 1ml 280 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-002 GenDepot 2x1ml 482 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-005 GenDepot 5x1ml 828 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-010 GenDepot 10x1ml 1360 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-001 GenDepot 1ml 146 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-050 GenDepot 50x1ml 1670 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-001 GenDepot 1ml 174 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-050 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-001 GenDepot 1ml 146 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-005 GenDepot 5x1ml 269 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-010 GenDepot 10x1ml 448 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-050 GenDepot 50x1ml 1738 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-001 GenDepot 1ml 146 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-050 GenDepot 50x1ml 1670 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5603-001 GenDepot 1ml 146 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5603-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5603-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5603-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5603-050 GenDepot 50x1ml 1670 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-001 GenDepot 1ml 174 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-050 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-001 GenDepot 1ml 174 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-050 GenDepot 50x1ml 334 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-001 GenDepot 1ml 174 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-003 GenDepot 5x1ml 469 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-004 GenDepot 10x1ml 739 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-005 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-010 GenDepot 2X50 rxns 151 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-025 GenDepot 5X50 rxns 273 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-050 GenDepot 10X50 rxns 448 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-250 GenDepot 50x50 rxns 1873 EUR

PCR-EZ D-PCR MASTER MIX

BS294 Bio Basic 100RXN, 100prep 93.5 EUR

HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

BS9291 Bio Basic 5X1mL, 5ml 209.5 EUR

HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

BS9292 Bio Basic 1ml 96.4 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

BS9295 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

BS9296 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

BS9297 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

BS9298 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)

MB1002-100reactions BosterBio 100 reactions 514 EUR

Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)

MB1002-200reactions BosterBio 200 reactions 746 EUR

Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)

MB1002-25reactions BosterBio 25 reactions 189 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 253 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-025 GenDepot 5X50 rxns 455 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-050 GenDepot 10X50 rxns 779 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-100 GenDepot 20x50 rxns 1333 EUR

2×Taq PCR Master Mix(with dye)

K1034-1 ApexBio 1 ml 73 EUR

2×Taq PCR Master Mix(with dye)

K1034-100 ApexBio 100×1 ml 792 EUR

2×Taq PCR Master Mix(with dye)

K1034-20 ApexBio 20×1 ml 282 EUR

2×Taq PCR Master Mix(with dye)

K1034-5 ApexBio 5×1 ml 119 EUR

2×Taq PCR Master Mix(with dye)

K1034-50 ApexBio 50×1 ml 514 EUR

Jade? Master Mix

M1105-500 Biovision 441 EUR

Taqman Master Mix

M1121-500 Biovision 441 EUR

Taqman Master Mix-iCycler

M1122-500 Biovision 441 EUR

Taqman Master Mix-ROX

M1124-500 Biovision 441 EUR

Taqman Master Mix-Multiplex

M1125-500 Biovision 441 EUR

2 × Taq Master Mix

P111-01 Vazyme 5 ml 117 EUR

2 × Taq Master Mix

P111-02 Vazyme 15 ml 146 EUR

2 × Taq Master Mix

P111-03 Vazyme 50 ml 236 EUR

2 × AceTaq Master Mix

P411-01 Vazyme 1 ml 119 EUR

2 × AceTaq Master Mix

P411-02 Vazyme 5 ml 158 EUR

2 × AceTaq Master Mix

P411-03 Vazyme 15 ml 262 EUR

Accuris Taq Master Mix

PR1001-1000 Benchmark Scientific 1 PC 300.26 EUR

Einstufige qRT-PCR Einstufige qRT-PCR kombiniert die Erststrang-cDNASynthesereaktion und Echtzeit-PCR-Reaktion in dergleichen Röhrchen, vereinfacht den Reaktionsaufbau und reduziert die Möglichkeit einer Kontamination. Genspezifische Primer sind erforderlich. Dies liegt an der Verwendung von Oligo(dT) oder Random Primer erzeugen in einem Schritt unspezifische Produkte Verfahren und reduzieren Sie die Menge des gewünschten Produkts.

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