amfiSure PCR-Master-Mix

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine der leistungsstärksten Technologien in der Molekularbiologie. Mithilfe von PCR können spezifische Sequenzen innerhalb einer DNA- oder komplementären DNA (cDNA)-Matrize kopiert oder viele tausend- bis millionenfach „amplifiziert“ werden, indem sequenzspezifische Oligonukleotide, hitzestabile DNA-Polymerase, und thermisches Radfahren. Bei der traditionellen (Endpunkt-)PCR erfolgen der Nachweis und die Quantifizierung der amplifizierten Sequenz am Ende der Reaktion nach dem letzten PCR-Zyklus und beinhalten Post-PCR-Analysen wie Gelelektrophorese und Bildanalyse.

Bei der quantitativen Real-Time-PCR (oft abgekürzt Real-Time-PCR bzw qPCR), wird das PCR-Produkt bei jedem Zyklus gemessen. Durch Überwachung der Reaktionen während der exponentiellen Amplifikationsphase der Reaktion können Benutzer die anfängliche Menge des Ziels mit großer Präzision bestimmen.

PCR amplifiziert DNA theoretisch exponentiell, wodurch die Anzahl der Zielmoleküle mit jedem Amplifikationszyklus verdoppelt wird.

Als es erstmals entwickelt wurde, argumentierten die Wissenschaftler, dass die Anzahl der Zyklen und die Menge des PCR-Endprodukts verwendet werden könnten, um die anfängliche Menge an genetischem Material durch Vergleich mit einem bekannten Standard zu berechnen. Um der Notwendigkeit einer robusten Quantifizierung gerecht zu werden, wurde die Technik der Echtzeit-PCR entwickelt. Gegenwärtig wird die Endpunkt-PCR hauptsächlich verwendet, um spezifische DNA für die Sequenzierung, Klonierung und Verwendung in anderen molekularbiologischen Techniken zu amplifizieren.

• Bei der Echtzeit-PCR wird die DNA-Menge nach jedem Zyklus über fluoreszierende Farbstoffe gemessen, die ein zunehmendes Fluoreszenzsignal liefern, das direkt proportional zur Anzahl der erzeugten PCR-Produktmoleküle (Amplikons) ist. Daten, die in der exponentiellen Phase der Reaktion gesammelt werden, liefern quantitative Informationen über die Ausgangsmenge des Amplifikationsziels.
• Fluoreszierende Reporter, die in der Echtzeit-PCR verwendet werden, umfassen doppelsträngige DNA (dsDNA)-bindende Farbstoffe oder Farbstoffmoleküle, die an PCR-Primer oder Sonden gebunden sind, die während der Amplifikation mit PCR-Produkten hybridisieren.
• Die Änderung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion wird durch ein Instrument gemessen, das thermische Zyklen mit der Fähigkeit zum Scannen von Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert. Durch Auftragen der Fluoreszenz gegen die Zyklusnummer erstellt das Echtzeit-PCR-Instrument ein Amplifikationsdiagramm, das die Akkumulation des Produkts über die Dauer der gesamten PCR darstellt.

Zu den Vorteilen der Echtzeit-PCR gehören:

• Möglichkeit, den Fortschritt einzelner PCR-Reaktionen in Echtzeit zu überwachen
• Fähigkeit, die Menge an Amplikons bei jedem Zyklus genau zu messen, was eine hochgenaue Quantifizierung der Menge an Ausgangsmaterial in Proben ermöglicht
• Ein erhöhter dynamischer Erfassungsbereich
• Amplifikation und Detektion erfolgen in einem einzigen Röhrchen, wodurch Post-PCR-Manipulationen entfallen
In den letzten Jahren hat sich die Echtzeit-PCR zum führenden Werkzeug für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA oder RNA entwickelt. Die Verwendung dieser Techniken ermöglicht eine präzise Erkennung, die innerhalb eines 2-fachen Bereichs genau ist, wobei der dynamische Bereich des Eingangsmaterials 6 bis 8 Größenordnungen abdeckt.

Überblick über real-time PCR

Dieser Abschnitt gibt einen Überblick über die erforderlichen Schritte bei der Durchführung von Echtzeit-PCR. Real-Time-PCR ist eine Variante der allgemein verwendeten Standard-PCR-Technik um DNA oder RNA in einer Probe zu quantifizieren. Mithilfe sequenzspezifischer Primer wird die Anzahl der Kopien einer bestimmten DNA ermittelt oder RNA-Sequenz bestimmt werden. Durch die Messung der Menge des amplifizierten Produkts in jeder Stufe während der PCR Zyklus ist eine Quantifizierung möglich. Wenn eine bestimmte Sequenz (DNA oder RNA) in der Probe reichlich vorhanden ist, Amplifikation wird in früheren Zyklen beobachtet; wenn die Folge knapp ist, Amplifikation wird in späteren Zyklen beobachtet. Quantifizierung von
amplifiziertes Produkt wird unter Verwendung von fluoreszierenden Sonden erhalten oder fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe und Echtzeit-PCRInstrumente, die die Fluoreszenz während der Durchführung messen die thermische Zyklierung für PCR.

Echtzeit-PCR-Schritte

Jeder Zyklus besteht aus drei Hauptschritten
Echtzeit-PCR. Reaktionen werden im Allgemeinen für 40 Zyklen durchgeführt.
1. Denaturierung – Hochtemperaturinkubation wird verwendet dsDNA in Einzelstränge „schmelzen“ und sekundär lösen Struktur in einzelsträngiger DNA (ssDNA). Das höchste Temperatur, der die DNA-Polymerase widerstehen kann, ist typischerweise verwendet (normalerweise 95°C). Die Denaturierungszeit kann
erhöht werden, wenn der Templat-GC-Gehalt hoch ist.
2. Glühen – während des Glühens ergänzend Sequenzen haben die Möglichkeit zu hybridisieren, so an
geeignete Temperatur verwendet wird, die auf der basiert berechnete Schmelztemperatur (Tm) der Primer
(typischerweise 5°C unter der Tm der Grundierung).
3. Verlängerung – bei 70–72°C die Aktivität der DNA Polymerase ist optimal, und es findet eine Primerverlängerung statt mit Raten von bis zu 100 Basen pro Sekunde. Wenn ein Amplikon in Echtzeit-PCR ist klein, dieser Schritt ist oft kombiniert mit dem Temperschritt unter Verwendung von 60°C als
die Temperatur.

Zweistufige qRT-PCR
Die zweistufige quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRTPCR) beginnt mit der reversen Transkription von beiden Gesamt-RNA oder Poly(A)-RNA in cDNA unter Verwendung einer Umkehrung Transkriptase. Diese Erststrang-cDNA-Synthesereaktion kann unter Verwendung von zufälligen Primern, Oligo(dT) oder genspezifischen Primern geprimt werden. Alle gleichermaßen vertreten Targets in Echtzeit-PCR-Anwendungen und zur Vermeidung des 3’Bias von Oligo(dT)-Primern verwenden viele Forscher zufällig Primer oder eine Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Primern. Die für die cDNA-Synthese verwendete Temperatur hängt von der ab reverse Transkriptase gewählt. Nach der umgekehrten Transkription etwa 10 % der cDNA werden auf a übertragen separates Röhrchen für die Echtzeit-PCR.

amfiSure PCR Master Mix
P0311-010	GenDepot	2x50 rxns	151.2 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-025	GenDepot	5X50 rxns	198 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-050	GenDepot	10X50 rxns	262.8 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-100	GenDepot	10x1ml	343.2 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-125	GenDepot	15X50 rxns	333.6 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-200	GenDepot	20x1ml	562.8 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-250	GenDepot	50x50 rxns	902.4 EUR
amfiSure PCR Master Mix
P0311-500	GenDepot	100x50 rxns	1509.6 EUR
amfiSure Prime PCR Master Mix
P1311-025	GenDepot	5X50 rxns	193.2 EUR
amfiSure Prime PCR Master Mix
P1311-050	GenDepot	10X50 rxns	262.8 EUR
amfiSure Prime PCR Master Mix
P1311-125	GenDepot	15X50 rxns	327.6 EUR
amfiSure Prime PCR Master Mix
P1311-500	GenDepot	100x50 rxns	1485.6 EUR
amfiSure Advanced PCR Master Mix
P2311-025	GenDepot	5X50 rxns	198 EUR
amfiSure Advanced PCR Master Mix
P2311-050	GenDepot	10X50 rxns	267.6 EUR
amfiSure Advanced PCR Master Mix
P2311-125	GenDepot	15X50 rxns	338.4 EUR
amfiSure Advanced PCR Master Mix
P2311-250	GenDepot	50x50 rxns	902.4 EUR
amfiSure Advanced PCR Master Mix
P2311-500	GenDepot	100x50 rxns	1534.8 EUR
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)
P7000-005	GenDepot	5x1 ml	262.8 EUR
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)
P7000-010	GenDepot	10x1 ml	380.4 EUR
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)
P7000-050	GenDepot	50x1 ml	1453.2 EUR
amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)
P7000-100	GenDepot	100x1 ml	2522.4 EUR
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0346-001	GenDepot	1ml	336 EUR
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0346-002	GenDepot	2x1ml	578.4 EUR
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0346-005	GenDepot	5x1ml	993.6 EUR
amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0346-010	GenDepot	10x1ml	1632 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5601-001	GenDepot	1ml	175.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5601-002	GenDepot	2x1ml	248.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5601-005	GenDepot	5x1ml	319.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5601-010	GenDepot	10x1ml	530.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5601-050	GenDepot	50x1ml	2004 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5701-001	GenDepot	1ml	208.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5701-002	GenDepot	2x1ml	319.2 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5701-005	GenDepot	5x1ml	562.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5701-010	GenDepot	10x1ml	886.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein
Q5701-050	GenDepot	50x1ml	3462 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5600-001	GenDepot	1ml	175.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5600-002	GenDepot	2x1ml	248.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5600-005	GenDepot	5x1ml	322.8 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5600-010	GenDepot	10x1ml	537.6 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5600-050	GenDepot	50x1ml	2085.6 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5602-001	GenDepot	1ml	175.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5602-002	GenDepot	2x1ml	248.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5602-005	GenDepot	5x1ml	319.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5602-010	GenDepot	10x1ml	530.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5602-050	GenDepot	50x1ml	2004 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5603-001	GenDepot	1ml	175.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5603-002	GenDepot	2x1ml	248.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5603-005	GenDepot	5x1ml	319.2 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5603-010	GenDepot	10x1ml	530.4 EUR
amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5603-050	GenDepot	50x1ml	2004 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5700-001	GenDepot	1ml	208.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5700-002	GenDepot	2x1ml	319.2 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5700-005	GenDepot	5x1ml	562.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5700-010	GenDepot	10x1ml	886.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox
Q5700-050	GenDepot	50x1ml	3462 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5702-001	GenDepot	1ml	208.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5702-002	GenDepot	2x1ml	319.2 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5702-005	GenDepot	5x1ml	562.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5702-010	GenDepot	10x1ml	886.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox
Q5702-050	GenDepot	50x1ml	400.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5703-001	GenDepot	1ml	208.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5703-002	GenDepot	2x1ml	319.2 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5703-003	GenDepot	5x1ml	562.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5703-004	GenDepot	10x1ml	886.8 EUR
amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox
Q5703-005	GenDepot	50x1ml	3462 EUR
amfiXpand PCR Master Mix
P0331-010	GenDepot	2X50 rxns	181.2 EUR
amfiXpand PCR Master Mix
P0331-025	GenDepot	5X50 rxns	327.6 EUR
amfiXpand PCR Master Mix
P0331-050	GenDepot	10X50 rxns	537.6 EUR
amfiXpand PCR Master Mix
P0331-250	GenDepot	50x50 rxns	2247.6 EUR
PCR-EZ D-PCR MASTER MIX
BS294	Bio Basic	100RXN, 100prep	112.2 EUR
lyophilised real-time PCR Master Mix for dual labeled probes
M-PCR-156L	MiTeGen	960 reactions x 20 µl	900.68 EUR
lyophilised real-time PCR Master Mix for dual labeled probes
M-PCR-156S	MiTeGen	192 reactions x 20 µl	225.3 EUR
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)
BS9291	Bio Basic	5X1mL, 5ml	251.4 EUR
HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)
BS9292	Bio Basic	1ml	115.68 EUR
Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)
BS9295	Bio Basic	1ml	101.76 EUR
Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)
BS9296	Bio Basic	5ml	227.04 EUR
Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)
BS9297	Bio Basic	1ml	101.76 EUR
Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)
BS9298	Bio Basic	5ml	227.04 EUR
Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)
MB1002-100reactions	BosterBio	100 reactions	616.8 EUR
Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)
MB1002-200reactions	BosterBio	200 reactions	895.2 EUR
Reverse Transcriptase RT PCR Master Mix (5X)
MB1002-25reactions	BosterBio	25 reactions	226.8 EUR
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0342-010	GenDepot	2x50 rxns	303.6 EUR
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0342-025	GenDepot	5X50 rxns	546 EUR
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0342-050	GenDepot	10X50 rxns	934.8 EUR
amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)
P0342-100	GenDepot	20x50 rxns	1599.6 EUR
2×Taq PCR Master Mix(with dye)
K1034-1	ApexBio	1 ml	87.6 EUR
2×Taq PCR Master Mix(with dye)
K1034-100	ApexBio	100×1 ml	950.4 EUR
2×Taq PCR Master Mix(with dye)
K1034-20	ApexBio	20×1 ml	338.4 EUR
2×Taq PCR Master Mix(with dye)
K1034-5	ApexBio	5×1 ml	142.8 EUR
2×Taq PCR Master Mix(with dye)
K1034-50	ApexBio	50×1 ml	616.8 EUR
lyophilised real-time PCR Master Mix with SYBR® Green fluorescent DNA stain
M-PCR-173L	MiTeGen	960 reactions x 20 µl	789.36 EUR
lyophilised real-time PCR Master Mix with SYBR® Green fluorescent DNA stain
M-PCR-173S	MiTeGen	192 reactions x 20 µl	197.34 EUR
Jade? Master Mix
M1105-500	Biovision	each	529.2 EUR
Taqman Master Mix
M1121-500	Biovision	each	529.2 EUR
2 × Taq Master Mix
P111-01	Vazyme	5 ml	140.4 EUR
2 × Taq Master Mix
P111-02	Vazyme	15 ml	175.2 EUR
2 × Taq Master Mix
P111-03	Vazyme	50 ml	283.2 EUR
2 × AceTaq Master Mix
P411-01	Vazyme	1 ml	142.8 EUR
2 × AceTaq Master Mix
P411-02	Vazyme	5 ml	189.6 EUR
2 × AceTaq Master Mix
P411-03	Vazyme	15 ml	314.4 EUR

Einstufige qRT-PCR Einstufige qRT-PCR kombiniert die Erststrang-cDNASynthesereaktion und Echtzeit-PCR-Reaktion in dergleichen Röhrchen, vereinfacht den Reaktionsaufbau und reduziert die Möglichkeit einer Kontamination. Genspezifische Primer sind erforderlich. Dies liegt an der Verwendung von Oligo(dT) oder Random Primer erzeugen in einem Schritt unspezifische Produkte Verfahren und reduzieren Sie die Menge des gewünschten Produkts.