amfiSure PCR-Master-Mix

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine der leistungsstärksten Technologien in der Molekularbiologie. Mithilfe von PCR können spezifische Sequenzen innerhalb einer DNA- oder komplementären DNA (cDNA)-Matrize kopiert oder viele tausend- bis millionenfach „amplifiziert“ werden, indem sequenzspezifische Oligonukleotide, hitzestabile DNA-Polymerase, und thermisches Radfahren. Bei der traditionellen (Endpunkt-)PCR erfolgen der Nachweis und die Quantifizierung der amplifizierten Sequenz am Ende der Reaktion nach dem letzten PCR-Zyklus und beinhalten Post-PCR-Analysen wie Gelelektrophorese und Bildanalyse.

Bei der quantitativen Real-Time-PCR (oft abgekürzt Real-Time-PCR bzw qPCR), wird das PCR-Produkt bei jedem Zyklus gemessen. Durch Überwachung der Reaktionen während der exponentiellen Amplifikationsphase der Reaktion können Benutzer die anfängliche Menge des Ziels mit großer Präzision bestimmen.

PCR amplifiziert DNA theoretisch exponentiell, wodurch die Anzahl der Zielmoleküle mit jedem Amplifikationszyklus verdoppelt wird.

Als es erstmals entwickelt wurde, argumentierten die Wissenschaftler, dass die Anzahl der Zyklen und die Menge des PCR-Endprodukts verwendet werden könnten, um die anfängliche Menge an genetischem Material durch Vergleich mit einem bekannten Standard zu berechnen. Um der Notwendigkeit einer robusten Quantifizierung gerecht zu werden, wurde die Technik der Echtzeit-PCR entwickelt. Gegenwärtig wird die Endpunkt-PCR hauptsächlich verwendet, um spezifische DNA für die Sequenzierung, Klonierung und Verwendung in anderen molekularbiologischen Techniken zu amplifizieren.

  • Bei der Echtzeit-PCR wird die DNA-Menge nach jedem Zyklus über fluoreszierende Farbstoffe gemessen, die ein zunehmendes Fluoreszenzsignal liefern, das direkt proportional zur Anzahl der erzeugten PCR-Produktmoleküle (Amplikons) ist. Daten, die in der exponentiellen Phase der Reaktion gesammelt werden, liefern quantitative Informationen über die Ausgangsmenge des Amplifikationsziels.
  • Fluoreszierende Reporter, die in der Echtzeit-PCR verwendet werden, umfassen doppelsträngige DNA (dsDNA)-bindende Farbstoffe oder Farbstoffmoleküle, die an PCR-Primer oder Sonden gebunden sind, die während der Amplifikation mit PCR-Produkten hybridisieren.
  • Die Änderung der Fluoreszenz im Verlauf der Reaktion wird durch ein Instrument gemessen, das thermische Zyklen mit der Fähigkeit zum Scannen von Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert. Durch Auftragen der Fluoreszenz gegen die Zyklusnummer erstellt das Echtzeit-PCR-Instrument ein Amplifikationsdiagramm, das die Akkumulation des Produkts über die Dauer der gesamten PCR darstellt.

Zu den Vorteilen der Echtzeit-PCR gehören:

• Möglichkeit, den Fortschritt einzelner PCR-Reaktionen in Echtzeit zu überwachen
• Fähigkeit, die Menge an Amplikons bei jedem Zyklus genau zu messen, was eine hochgenaue Quantifizierung der Menge an Ausgangsmaterial in Proben ermöglicht
• Ein erhöhter dynamischer Erfassungsbereich
• Amplifikation und Detektion erfolgen in einem einzigen Röhrchen, wodurch Post-PCR-Manipulationen entfallen
In den letzten Jahren hat sich die Echtzeit-PCR zum führenden Werkzeug für den Nachweis und die Quantifizierung von DNA oder RNA entwickelt. Die Verwendung dieser Techniken ermöglicht eine präzise Erkennung, die innerhalb eines 2-fachen Bereichs genau ist, wobei der dynamische Bereich des Eingangsmaterials 6 bis 8 Größenordnungen abdeckt.

Überblick über real-time PCR

Dieser Abschnitt gibt einen Überblick über die erforderlichen Schritte bei der Durchführung von Echtzeit-PCR. Real-Time-PCR ist eine Variante der allgemein verwendeten Standard-PCR-Technik um DNA oder RNA in einer Probe zu quantifizieren. Mithilfe sequenzspezifischer Primer wird die Anzahl der Kopien einer bestimmten DNA ermittelt oder RNA-Sequenz bestimmt werden. Durch die Messung der Menge des amplifizierten Produkts in jeder Stufe während der PCR Zyklus ist eine Quantifizierung möglich. Wenn eine bestimmte Sequenz (DNA oder RNA) in der Probe reichlich vorhanden ist, Amplifikation wird in früheren Zyklen beobachtet; wenn die Folge knapp ist, Amplifikation wird in späteren Zyklen beobachtet. Quantifizierung von
amplifiziertes Produkt wird unter Verwendung von fluoreszierenden Sonden erhalten oder fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe und Echtzeit-PCRInstrumente, die die Fluoreszenz während der Durchführung messen die thermische Zyklierung für PCR.

Echtzeit-PCR-Schritte

Jeder Zyklus besteht aus drei Hauptschritten
Echtzeit-PCR. Reaktionen werden im Allgemeinen für 40 Zyklen durchgeführt.
1. Denaturierung – Hochtemperaturinkubation wird verwendet dsDNA in Einzelstränge „schmelzen“ und sekundär lösen Struktur in einzelsträngiger DNA (ssDNA). Das höchste Temperatur, der die DNA-Polymerase widerstehen kann, ist typischerweise verwendet (normalerweise 95°C). Die Denaturierungszeit kann
erhöht werden, wenn der Templat-GC-Gehalt hoch ist.
2. Glühen – während des Glühens ergänzend Sequenzen haben die Möglichkeit zu hybridisieren, so an
geeignete Temperatur verwendet wird, die auf der basiert berechnete Schmelztemperatur (Tm) der Primer
(typischerweise 5°C unter der Tm der Grundierung).
3. Verlängerung – bei 70–72°C die Aktivität der DNA Polymerase ist optimal, und es findet eine Primerverlängerung statt mit Raten von bis zu 100 Basen pro Sekunde. Wenn ein Amplikon in Echtzeit-PCR ist klein, dieser Schritt ist oft kombiniert mit dem Temperschritt unter Verwendung von 60°C als
die Temperatur.

Zweistufige qRT-PCR
Die zweistufige quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRTPCR) beginnt mit der reversen Transkription von beiden Gesamt-RNA oder Poly(A)-RNA in cDNA unter Verwendung einer Umkehrung Transkriptase. Diese Erststrang-cDNA-Synthesereaktion kann unter Verwendung von zufälligen Primern, Oligo(dT) oder genspezifischen Primern geprimt werden. Alle gleichermaßen vertreten Targets in Echtzeit-PCR-Anwendungen und zur Vermeidung des 3’Bias von Oligo(dT)-Primern verwenden viele Forscher zufällig Primer oder eine Mischung aus Oligo(dT) und zufälligen Primern. Die für die cDNA-Synthese verwendete Temperatur hängt von der ab reverse Transkriptase gewählt. Nach der umgekehrten Transkription etwa 10 % der cDNA werden auf a übertragen separates Röhrchen für die Echtzeit-PCR.

amfiSure PCR Master Mix

P0311-010 GenDepot 2x50 rxns 151.2 EUR

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P0311-025 GenDepot 5X50 rxns 198 EUR

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amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-025 GenDepot 5X50 rxns 198 EUR

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-005 GenDepot 5x1 ml 262.8 EUR

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P7000-100 GenDepot 100x1 ml 2522.4 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

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P0346-010 GenDepot 10x1ml 1632 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye

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amfiSure ONE PCR Master Mix(2X), Without Dye

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amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5600-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

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Q5603-010 GenDepot 10x1ml 530.4 EUR

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Q5603-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

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Q5703-004 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

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Q5703-050 GenDepot 50x1ml 1910 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

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amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-050 GenDepot 50x1ml 3462 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5602-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

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Q5602-010 GenDepot 10x1ml 530.4 EUR

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Q5602-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

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Q5702-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

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Q5702-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

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Q5702-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-050 GenDepot 50x1ml 400.8 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-001 GenDepot 1ml 180 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-005 GenDepot 5x1ml 690 EUR

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Q6000-010 GenDepot 10x1ml 1230 EUR

amfiSure 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X)

Q6000-050 GenDepot 50ml 3900 EUR

amfiSure qGreen 1-Step RT-qPCR Master Mix (2X), No Rox

Q6700-050 GenDepot 50 rxns 195 EUR

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Q6700-200 GenDepot 4x50 rxns 580 EUR

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amfiXpand PCR Master Mix

P0331-010 GenDepot 2X50 rxns 181.2 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-025 GenDepot 5X50 rxns 327.6 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-050 GenDepot 10X50 rxns 537.6 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-250 GenDepot 50x50 rxns 2247.6 EUR

amfiSure ONE PCR Premix

P7001-096 GenDepot 96 rxns 105 EUR

amfiSure LQ Long PCR Polymerase

P0326-010 GenDepot 100 units 230.4 EUR

amfiSure LQ Long PCR Polymerase

P0326-025 GenDepot 250 units 400.8 EUR

amfiSure Direct PCR Lysis Buffer

D0300-010 GenDepot 100ml 165.6 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 303.6 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-025 GenDepot 5X50 rxns 546 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-050 GenDepot 10X50 rxns 934.8 EUR

Einstufige qRT-PCR Einstufige qRT-PCR kombiniert die Erststrang-cDNASynthesereaktion und Echtzeit-PCR-Reaktion in dergleichen Röhrchen, vereinfacht den Reaktionsaufbau und reduziert die Möglichkeit einer Kontamination. Genspezifische Primer sind erforderlich. Dies liegt an der Verwendung von Oligo(dT) oder Random Primer erzeugen in einem Schritt unspezifische Produkte Verfahren und reduzieren Sie die Menge des gewünschten Produkts.

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