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Abstrakt
Die Entwicklungsursprünge mesenchymaler Vorläuferzellen (MPCs) und molekularer Mechanismen, die ihr Schicksal und ihre Differenzierung regulieren, sind aufgrund ihrer Komplexität noch lange nicht definiert. Osteoblasten und Adipozyten stammen von gewöhnlichen MPCs ab.Ihr Schicksal wird kollektiv von einem Orchester von Signalwegen als Reaktion auf physiologische und externe Signale bestimmt. Der kanonische Wnt-Weg signalisiert MPCs, sich auf Kosten des adipogenen Schicksals einer osteogenen Differenzierung zu verpflichten. Im Gegensatz zu ß-Catenin ist die antiosteogene Funktion von p53 viel weniger verstanden. Es wird angenommen, dass beide Aktivitäten durch das Targeting der Transkription von Runx2 und/oder Osterix (Osx, Sp7) erreicht werden. Wie genau die Osx-Aktivität durch ß-Catenin oder p53 diktiert wird, ist nicht geklärt und stellt eine Wissenslücke dar, die bisher weitgehend als selbstverständlich angesehen wurde.

Unter Verwendung konditionaler Lineage-Tracing-Mäuse zeigten wir, dass Chondrozyten zu einer beträchtlichen Fraktion von MPCs führten, die als Vorläufer von Chondrozyten-abgeleiteten Osteoblasten (Chon-ob) dienten. Wnt/ß-Catenin-Aktivität war nur im Stadium des von Chondrozyten stammenden mesenchymalen Vorläufers (C-MPC) bis zur Chon-ob-Differenzierung erforderlich. ß-Catenin-C-MPCs verloren ihre osteogene Fähigkeit und begünstigten die Adipogenese. Mechanistisch entdeckten wir, dass die p53-Aktivität in ß-Catenin-MPCs einschließlich ß-Catenin-C-MPCs erhöht war, und die Deletion von p53 aus den ß-Catenin-MPCs stellte die Osteogenese vollständig wieder her. Während in den Kernen von ß-Catenin-MPCs hohe Konzentrationen von p53 vorhanden waren, war Osx auf das Zytoplasma beschränkt, was auf einen Mechanismus hindeutet, der keine direkte p53-Osx-Wechselwirkung beinhaltet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die anti-osteogene Aktivität von p53 von seiner DNA-Bindungsfähigkeit abhängig war. Unsere Ergebnisse identifizieren Chondrozyten als zusätzliche Quelle für MPCs und weisen darauf hin, dass Wnt/ß-Catenin diskret die Entwicklung von Chondrozyten zu C-MPC und die anschließende Entwicklung von C-MPC zu Osteoblasten reguliert. Vor allem enthüllen wir eine bisher unerkannte funktionelle Verbindung zwischen ß-Catenin und p53 und stellen die negative Rolle von p53 in den Kontext der Wnt/ß-Catenin-Signal-induzierten osteogenen MPC-Differenzierung.

Einführung

Die endochondrale Knochenbildung erfolgt durch einen Umwandlungsprozess von Knorpel zu Knochen, bei dem Knorpelgewebe sowohl als Vorlage für die Ossifikation als auch als angeborene Quelle für Osteoblasten dient1–6. Die zellulären Mittel, durch die ein vollständig differenzierter Chondrozyten die Plastizität erlangt, um sich zu einem reifen Osteoblasten zu entwickeln, sowie welche Signalwege dieses Ereignis steuern, bleiben schwer fassbar.

• Die kanonische Wnt-Signalübertragung spielt verschiedene Rollen in verschiedenen Stadien der Knochenentwicklung und des Knochenwachstums5–10. In Osx-exprimierenden MPCS spielt Wnt/ß-Catenin eine Schalterrolle zwischen osteogenem und adipogenem Schicksal.
• Trotz des Mangels an überzeugenden Beweisen7 wird derzeit akzeptiert, dass ß-Catenin die Osteogenese durch Aktivierung der Runx2- und/oder Osx-Transkription fördert11–13.p53 ist ein gut etablierter Tumorsuppressor.
• Es ist auch ein lebenswichtiger Regulator des Zellschicksals und der Zelldifferenzierung14. Die genauen Funktionen und Regulationsmechanismen der physiologischen Rollen von p53 werden noch viel weniger verstanden und geschätzt.
• In begrenzten Berichten wurde gezeigt, dass die Signalübertragung zwischen p53 und Wnt/ß-Catenin kontextabhängig verschiedene Rollen spielt, wie z. B. in glatten Muskelzellen15 und in embryonalen Stammzellen16.
• p53 zeigt in verschiedenen Mausmodellen eine osteoinhibierende Aktivität17,18 Dennoch sind p53-nachgelagerte molekulare Ereignisse, die zu einer osteogenen Inhibierung führen, noch nicht definiert. p53-Nullmark-mesenchymale Stammzellen sind osteogener und zeigen keinen offensichtlichen Unterschied in ihren adipogenen und chondrogenen Kapazitäten19,20.
• Eine Studie zeigt, dass p53 die osteoblastische Differenzierung durch microRNA-34-vermittelte Runx2-Suppression hemmt21,22. Bis heute ist der physiologische Kontext dieser inhibitorischen Funktion völlig unklar.

Hier verwendeten wir Collagen X (Col10a1) und Aggrecan (Agc1)-gesteuerte ß-Catenin konditionale Lineage-Tracing-Mäuse, um zu beschreiben, wie Wnt/ß-Catenin die Reprogrammierung von Chondrozyten zu Osteoblasten reguliert. Wir haben gezeigt, dass sich Chondrozyten über mindestens zwei Schritte zu Osteoblasten entwickelt haben, die unterschiedlich durch Wnt/ß-Catenin reguliert wurden. Mechanistisch entdeckten wir, dass die ß-Catenin-defizienten MPCS eine erhöhte p53-Aktivität erlangten und ihr Mangel an osteogener Kapazität vollständig wiederhergestellt wurde, indem lediglich p53 aus ihnen entfernt wurde, was darauf hindeutet, dass Wnt/ß-Catenin die Osteogenese über einen p53-Suppressions-abhängigen Mechanismus fördert.

Ergebnisse

Charakterisierungen von Chondrozyten-Cre-vermittelten β-Catenin-Mutantenmäusen zeigen eine umgekehrte Korrelation zwischen den trabekulären Volumina und der Anzahl von Chondrozyten-abgeleiteten Stromazellen
Um ein mechanistisches Verständnis der von Chondrozyten initiierten Wnt / β-Catenin-Aktion zu erlangen, haben wir Mausmodelle zur Verfolgung von Chondrozyten-Linien erstellt, die entweder gelöschte oder stabilisierte ß-Catenin-Allele enthalten, und die Reporter-exprimierenden Zellen systematisch quantifiziert und verglichen, kategorisiert nach Standort und Assoziation mit Knochenmatrix.
In den Femuren postnataler Tiere wurde eine reichliche Anzahl Tomaten-exprimierender (Tm+) Zellen in der Markhöhle sowohl der Col10a1-Cre;ROSA26R-Tomate (XTomato)-Kontrolle als auch der Col10a1-Cre;Ctnnb1fl/fl;ROSA26R-Tomate ( X/CKOTomato) mutierte Tiere, von denen jedes ein unterschiedliches Verteilungsmuster aufwies. Am postnatalen Tag 2 (p2) des XTomato-Kontrolltiers war die Mehrheit der Col10a1-Cre-induzierten Tm+ (X/Tm+)-Zellen an der primären Spongiosa lokalisiert, die physisch in Kontakt mit Trabekeln (Trabekel-gebunden) war, und zeigte eine reife Osteoblasten-ähnliche Morphologie (Abb. 1Aa). Im Gegensatz dazu waren die meisten der Tm+ (XCKO/Tm+)-Zellen im p2 X/CKOTomato-Mutantentier ziemlich gleichmäßig über die Markhöhle verteilt. Die meisten von ihnen waren nicht mit Trabekeln (nicht trabekelgebunden) verbunden und unterschieden sich morphologisch von reifen Osteoblasten. In ähnlicher Weise gab es bei p16 mehr nicht an die Trabekel gebundene Tm+-Zellen in der X/CKOTomato-Mutante als in den XTomato-Kontrollmäusen (6/ko vs. 2,4/con-Zellen/10 mm2), wohingegen weniger XCKO/Tm+-Zellen auf gefunden wurden die Endostea (0,63/ko vs. 6/con-Zellen/100 µm), eingebettet in Cortices (0/ko vs. 13,4/con-Zellen/10 mm2) oder Trabekelmatrizen (16,6/ko vs. 38,9/con-Zellen/10 mm2) im Vergleich zu die X/Tm+-Zellen .

Dieser Phänotyp blieb bestehen und wurde mit zunehmendem Alter immer ausgeprägter. Im Knochenmark von 4 und 8 Monate alten X/CKOTomato-Mäusen gab es sichtbar mehr nicht an Trabekel gebundene XCKO/Tm+-Zellen als in dem von p16, dessen nicht an Trabekel gebundene XCKO/Tm+-Zellen dazwischen verstreut blieben Stromazellen und waren nicht in die Rinden eingebettet.