amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Abstrakt
Die Entwicklungsursprünge mesenchymaler Vorläuferzellen (MPCs) und molekularer Mechanismen, die ihr Schicksal und ihre Differenzierung regulieren, sind aufgrund ihrer Komplexität noch lange nicht definiert. Osteoblasten und Adipozyten stammen von gewöhnlichen MPCs ab.Ihr Schicksal wird kollektiv von einem Orchester von Signalwegen als Reaktion auf physiologische und externe Signale bestimmt. Der kanonische Wnt-Weg signalisiert MPCs, sich auf Kosten des adipogenen Schicksals einer osteogenen Differenzierung zu verpflichten. Im Gegensatz zu ß-Catenin ist die antiosteogene Funktion von p53 viel weniger verstanden. Es wird angenommen, dass beide Aktivitäten durch das Targeting der Transkription von Runx2 und/oder Osterix (Osx, Sp7) erreicht werden. Wie genau die Osx-Aktivität durch ß-Catenin oder p53 diktiert wird, ist nicht geklärt und stellt eine Wissenslücke dar, die bisher weitgehend als selbstverständlich angesehen wurde.

Unter Verwendung konditionaler Lineage-Tracing-Mäuse zeigten wir, dass Chondrozyten zu einer beträchtlichen Fraktion von MPCs führten, die als Vorläufer von Chondrozyten-abgeleiteten Osteoblasten (Chon-ob) dienten. Wnt/ß-Catenin-Aktivität war nur im Stadium des von Chondrozyten stammenden mesenchymalen Vorläufers (C-MPC) bis zur Chon-ob-Differenzierung erforderlich. ß-Catenin-C-MPCs verloren ihre osteogene Fähigkeit und begünstigten die Adipogenese. Mechanistisch entdeckten wir, dass die p53-Aktivität in ß-Catenin-MPCs einschließlich ß-Catenin-C-MPCs erhöht war, und die Deletion von p53 aus den ß-Catenin-MPCs stellte die Osteogenese vollständig wieder her. Während in den Kernen von ß-Catenin-MPCs hohe Konzentrationen von p53 vorhanden waren, war Osx auf das Zytoplasma beschränkt, was auf einen Mechanismus hindeutet, der keine direkte p53-Osx-Wechselwirkung beinhaltet. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die anti-osteogene Aktivität von p53 von seiner DNA-Bindungsfähigkeit abhängig war. Unsere Ergebnisse identifizieren Chondrozyten als zusätzliche Quelle für MPCs und weisen darauf hin, dass Wnt/ß-Catenin diskret die Entwicklung von Chondrozyten zu C-MPC und die anschließende Entwicklung von C-MPC zu Osteoblasten reguliert. Vor allem enthüllen wir eine bisher unerkannte funktionelle Verbindung zwischen ß-Catenin und p53 und stellen die negative Rolle von p53 in den Kontext der Wnt/ß-Catenin-Signal-induzierten osteogenen MPC-Differenzierung.

Einführung

Die endochondrale Knochenbildung erfolgt durch einen Umwandlungsprozess von Knorpel zu Knochen, bei dem Knorpelgewebe sowohl als Vorlage für die Ossifikation als auch als angeborene Quelle für Osteoblasten dient1–6. Die zellulären Mittel, durch die ein vollständig differenzierter Chondrozyten die Plastizität erlangt, um sich zu einem reifen Osteoblasten zu entwickeln, sowie welche Signalwege dieses Ereignis steuern, bleiben schwer fassbar.

  • Die kanonische Wnt-Signalübertragung spielt verschiedene Rollen in verschiedenen Stadien der Knochenentwicklung und des Knochenwachstums5–10. In Osx-exprimierenden MPCS spielt Wnt/ß-Catenin eine Schalterrolle zwischen osteogenem und adipogenem Schicksal.
  • Trotz des Mangels an überzeugenden Beweisen7 wird derzeit akzeptiert, dass ß-Catenin die Osteogenese durch Aktivierung der Runx2- und/oder Osx-Transkription fördert11–13.p53 ist ein gut etablierter Tumorsuppressor.
  • Es ist auch ein lebenswichtiger Regulator des Zellschicksals und der Zelldifferenzierung14. Die genauen Funktionen und Regulationsmechanismen der physiologischen Rollen von p53 werden noch viel weniger verstanden und geschätzt.
  • In begrenzten Berichten wurde gezeigt, dass die Signalübertragung zwischen p53 und Wnt/ß-Catenin kontextabhängig verschiedene Rollen spielt, wie z. B. in glatten Muskelzellen15 und in embryonalen Stammzellen16.
  • p53 zeigt in verschiedenen Mausmodellen eine osteoinhibierende Aktivität17,18 Dennoch sind p53-nachgelagerte molekulare Ereignisse, die zu einer osteogenen Inhibierung führen, noch nicht definiert. p53-Nullmark-mesenchymale Stammzellen sind osteogener und zeigen keinen offensichtlichen Unterschied in ihren adipogenen und chondrogenen Kapazitäten19,20.
  • Eine Studie zeigt, dass p53 die osteoblastische Differenzierung durch microRNA-34-vermittelte Runx2-Suppression hemmt21,22. Bis heute ist der physiologische Kontext dieser inhibitorischen Funktion völlig unklar.

Hier verwendeten wir Collagen X (Col10a1) und Aggrecan (Agc1)-gesteuerte ß-Catenin konditionale Lineage-Tracing-Mäuse, um zu beschreiben, wie Wnt/ß-Catenin die Reprogrammierung von Chondrozyten zu Osteoblasten reguliert. Wir haben gezeigt, dass sich Chondrozyten über mindestens zwei Schritte zu Osteoblasten entwickelt haben, die unterschiedlich durch Wnt/ß-Catenin reguliert wurden. Mechanistisch entdeckten wir, dass die ß-Catenin-defizienten MPCS eine erhöhte p53-Aktivität erlangten und ihr Mangel an osteogener Kapazität vollständig wiederhergestellt wurde, indem lediglich p53 aus ihnen entfernt wurde, was darauf hindeutet, dass Wnt/ß-Catenin die Osteogenese über einen p53-Suppressions-abhängigen Mechanismus fördert.

Ergebnisse

Charakterisierungen von Chondrozyten-Cre-vermittelten β-Catenin-Mutantenmäusen zeigen eine umgekehrte Korrelation zwischen den trabekulären Volumina und der Anzahl von Chondrozyten-abgeleiteten Stromazellen
Um ein mechanistisches Verständnis der von Chondrozyten initiierten Wnt / β-Catenin-Aktion zu erlangen, haben wir Mausmodelle zur Verfolgung von Chondrozyten-Linien erstellt, die entweder gelöschte oder stabilisierte ß-Catenin-Allele enthalten, und die Reporter-exprimierenden Zellen systematisch quantifiziert und verglichen, kategorisiert nach Standort und Assoziation mit Knochenmatrix.
In den Femuren postnataler Tiere wurde eine reichliche Anzahl Tomaten-exprimierender (Tm+) Zellen in der Markhöhle sowohl der Col10a1-Cre;ROSA26R-Tomate (XTomato)-Kontrolle als auch der Col10a1-Cre;Ctnnb1fl/fl;ROSA26R-Tomate ( X/CKOTomato) mutierte Tiere, von denen jedes ein unterschiedliches Verteilungsmuster aufwies. Am postnatalen Tag 2 (p2) des XTomato-Kontrolltiers war die Mehrheit der Col10a1-Cre-induzierten Tm+ (X/Tm+)-Zellen an der primären Spongiosa lokalisiert, die physisch in Kontakt mit Trabekeln (Trabekel-gebunden) war, und zeigte eine reife Osteoblasten-ähnliche Morphologie (Abb. 1Aa). Im Gegensatz dazu waren die meisten der Tm+ (XCKO/Tm+)-Zellen im p2 X/CKOTomato-Mutantentier ziemlich gleichmäßig über die Markhöhle verteilt. Die meisten von ihnen waren nicht mit Trabekeln (nicht trabekelgebunden) verbunden und unterschieden sich morphologisch von reifen Osteoblasten. In ähnlicher Weise gab es bei p16 mehr nicht an die Trabekel gebundene Tm+-Zellen in der X/CKOTomato-Mutante als in den XTomato-Kontrollmäusen (6/ko vs. 2,4/con-Zellen/10 mm2), wohingegen weniger XCKO/Tm+-Zellen auf gefunden wurden die Endostea (0,63/ko vs. 6/con-Zellen/100 µm), eingebettet in Cortices (0/ko vs. 13,4/con-Zellen/10 mm2) oder Trabekelmatrizen (16,6/ko vs. 38,9/con-Zellen/10 mm2) im Vergleich zu die X/Tm+-Zellen .

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-005 GenDepot 5x1ml 319.2 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-010 GenDepot 10x1ml 530.4 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5602-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5600-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5600-005 GenDepot 5x1ml 322.8 EUR

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Q5600-010 GenDepot 10x1ml 537.6 EUR

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Q5600-050 GenDepot 50x1ml 2085.6 EUR

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Q5603-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5603-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

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Q5603-005 GenDepot 5x1ml 319.2 EUR

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Q5603-010 GenDepot 10x1ml 530.4 EUR

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Q5603-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5601-001 GenDepot 1ml 175.2 EUR

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Q5601-002 GenDepot 2x1ml 248.4 EUR

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Q5601-005 GenDepot 5x1ml 319.2 EUR

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Q5601-010 GenDepot 10x1ml 530.4 EUR

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Q5601-050 GenDepot 50x1ml 2004 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

Q5702-050 GenDepot 50x1ml 400.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

Q5700-050 GenDepot 50x1ml 3462 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

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Q5703-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-003 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-004 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

Q5703-005 GenDepot 50x1ml 3462 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-005 GenDepot 5x1 ml 262.8 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-010 GenDepot 10x1 ml 380.4 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-050 GenDepot 50x1 ml 1453.2 EUR

amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

P7000-100 GenDepot 100x1 ml 2522.4 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-010 GenDepot 2x50 rxns 151.2 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-025 GenDepot 5X50 rxns 198 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-050 GenDepot 10X50 rxns 262.8 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-100 GenDepot 10x1ml 343.2 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-125 GenDepot 15X50 rxns 333.6 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-200 GenDepot 20x1ml 562.8 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-250 GenDepot 50x50 rxns 902.4 EUR

amfiSure PCR Master Mix

P0311-500 GenDepot 100x50 rxns 1509.6 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-001 GenDepot 1ml 336 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-002 GenDepot 2x1ml 578.4 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-005 GenDepot 5x1ml 993.6 EUR

amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0346-010 GenDepot 10x1ml 1632 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-001 GenDepot 1ml 208.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-002 GenDepot 2x1ml 319.2 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-005 GenDepot 5x1ml 562.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-010 GenDepot 10x1ml 886.8 EUR

amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

Q5701-050 GenDepot 50x1ml 3462 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-025 GenDepot 5X50 rxns 193.2 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-050 GenDepot 10X50 rxns 262.8 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-125 GenDepot 15X50 rxns 327.6 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-250 GenDepot 50x50 rxns 886.8 EUR

amfiSure Prime PCR Master Mix

P1311-500 GenDepot 100x50 rxns 1485.6 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-025 GenDepot 5X50 rxns 198 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-050 GenDepot 10X50 rxns 267.6 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-125 GenDepot 15X50 rxns 338.4 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-250 GenDepot 50x50 rxns 902.4 EUR

amfiSure Advanced PCR Master Mix

P2311-500 GenDepot 100x50 rxns 1534.8 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 303.6 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-025 GenDepot 5X50 rxns 546 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-050 GenDepot 10X50 rxns 934.8 EUR

amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

P0342-100 GenDepot 20x50 rxns 1599.6 EUR

2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

B21402 Bimake 5 ml 268.8 EUR

2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

B21403 Bimake 25 ml 1027.2 EUR

SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

HY-K0521 MedChemExpress 1 mL (100 rxns) 135.6 EUR

ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)

Q341-02 Vazyme 500 rxns (20 μl/rxn) 96.44 EUR

ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)

Q341-03 Vazyme 2,500 rxns (20 μl/rxn) 434.8 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-010 GenDepot 2X50 rxns 181.2 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-025 GenDepot 5X50 rxns 327.6 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-050 GenDepot 10X50 rxns 537.6 EUR

amfiXpand PCR Master Mix

P0331-250 GenDepot 50x50 rxns 2247.6 EUR

ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed)

Q441-02 Vazyme 500 rxns (20 μl/rxn) 112.5 EUR

ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (High ROX Premixed)

Q441-03 Vazyme 2,500 rxns (20 μl/rxn) 507.2 EUR

TAQuestâ„¢ qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX*

17286-1mL AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuestâ„¢ qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX*

17287-5mL AAT Bioquest 5 mL 308 EUR

TAQuestâ„¢ qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX*

17274-1mL AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuestâ„¢ qPCR Master Mix with Helixyteâ„¢ Green *High ROX*

17275-5mL AAT Bioquest 5 mL 308 EUR

Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with high Rox (5000 rxn)

31015-2 Biotium 50x1mL 4291.2 EUR

Forget-Me-Notâ„¢ EvaGreen qPCR Master Mix (High ROX) (500 reactions)

9-31046 Biotium
  • 136.80 EUR
  • 578.40 EUR
  • 319.20 EUR
  • 1mL
  • 1X10mL
  • 5x1mL

Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix with high Rox (500 rxn)

31015-1 Biotium 5x1mL 524.4 EUR

amfiEco PCR Master Mix,8-Strip RTU(2X), for 50ul reaction

P0704-096 GenDepot 96 rxns 174 EUR

TAQuest™ qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX*

17286 AAT Bioquest 1 mL 99 EUR

TAQuest™ qPCR Master Mix for TaqMan Probes *High ROX*

17287 AAT Bioquest 5 mL 308 EUR

Dieser Phänotyp blieb bestehen und wurde mit zunehmendem Alter immer ausgeprägter. Im Knochenmark von 4 und 8 Monate alten X/CKOTomato-Mäusen gab es sichtbar mehr nicht an Trabekel gebundene XCKO/Tm+-Zellen als in dem von p16, dessen nicht an Trabekel gebundene XCKO/Tm+-Zellen dazwischen verstreut blieben Stromazellen und waren nicht in die Rinden eingebettet.

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