ABSTRAKT
WURZELHAARSPEZIFISCHE (RHS) Gene, die das wurzelhaarspezifische Cis-Element (RHE) in ihren regulatorischen Regionen enthalten, wirken bei der Wurzelhaarmorphogenese mit. Hier zeigen wir, dass ein grundlegender Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktor von Arabidopsis thaliana, ROOT HAIR DEFECTVE SIX-LIKE4 (RSL4), in vitro und in vivo direkt an die RHE bindet, RHS-Gene hochreguliert und die Wurzelhaarbildung in Arabidopsis stimuliert.
Orthologe von RSL4 aus einer Eudikotyle (Pappel [Populus trichocarpa]), einer Monokotyle (Reis [Oryza sativa]) und einem Lycophyten (Selaginella moellendorffii) stellten jeweils das Wurzelhaarwachstum in der Arabidopsis rsl4-Mutante wieder her. Außerdem banden die RSL4-Orthologe von Reis und S. moellendorffii in in-vitro- und in-vivo-Assays an RHE. Die orthologen RSL4-Gene enthalten RHEs in ihren Promotorregionen, und RSL4 war in der Lage, in vivo an seine eigenen RHEs zu binden und seine eigene Expression zu verstärken. Dieser Prozess bietet wahrscheinlich eine positive Rückkopplungsschleife für nachhaltiges Wurzelhaarwachstum. Wenn RSL4 und seine Orthologe in Zellen in Nicht-Wurzelhaarpositionen exprimiert wurden, induzierten sie ektopisches Wurzelhaarwachstum, was darauf hinweist, dass diese Gene ausreichen, um die Wurzelhaarbildung zu spezifizieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass RSL4 die Bildung von Wurzelhaaren vermittelt, indem es RHS-Gene reguliert, und dass dieser Mechanismus in der gesamten Abstammungslinie der Tracheophyten (Gefäßpflanzen) konserviert ist.
EINLEITUNG
Einzellige Zygoten entwickeln sich durch Zellteilung und -differenzierung zu mehrzelligen Organismen. Die Wurzelhaare von Gefäßpflanzen bieten ein nützliches Modell, um eine solche Zelldifferenzierung zu untersuchen.
- Jedes Wurzelhaar ist ein röhrenförmiger Vorsprung einer epidermalen Wurzelzelle, die die Aufnahme von Wasser und Nährstoffen, die Verankerung im Boden und die Interaktion mit Bodenmikroben unterstützt (Cutter, 1978).
- Wurzelhaare zeigen einen linearen Entwicklungsgradienten entlang der Wurzellängsachse vom Meristem zur Differenzierungszone, beginnend mit der Bestimmung des Zellschicksals, gefolgt von Initiation, Wulstbildung und schließlich Spitzenwachstum (Grierson und Schiefelbein, 2008).
- Drei Arten von Mechanismen zur Bestimmung des Zellschicksals in Wurzelepidermiszellen bestimmen, ob eine Zelle eine Wurzelhaarzelle oder eine Nicht-Wurzelhaarzelle wird: zufällig (Typ 1), asymmetrische Zellteilung (Typ 2) und positionsabhängig (Dolan, 1996; Clowes, 2000; Schiefelbein, 2000). Unter diesen wurde Typ 3 in Arabidopsis thaliana gut charakterisiert.
- In einer Nicht-Wurzel-Haarzellen-Position ein Komplex aus WEREWOLF (WER; ein MYB-Transkriptionsfaktor [TF]), GLABRA3/ENHANCER OF GLABRA3 (GL3/EGL3; basische Helix-Loop-Helix [bHLH] TFs) und TRANSPARENT TEST GLABRA (TTG; ein WD40-Protein) beeinflusst die Expression von GL2 (einer Homöodomäne TF) (Grierson und Schiefelbein 2008). GL2 unterdrückt direkt die Expression von ROOT HAIR DEFECTIVE6 (RHD6; ein bHLH TF), RHD6-LIKE1 (RSL1) und RSL2, was zu einer Hemmung der Wurzelhaarmorphogenese führt (Lin et al., 2015).
- An der Position der Wurzelhaarzelle empfängt SCRAMBLED (eine Leucin-reiche Wiederholungsrezeptor-ähnliche Proteinkinase) wahrscheinlich externe Signale von inneren Geweben (Kwak et al., 2005) und unterdrückt die Expression von WER, um die Bildung des Komplexes zu hemmen mit GL3/EGL3 und TTG, was die Expression von RHD6 und die nachfolgende Wurzelhaarmorphogenese ermöglicht (Kwak und Schiefelbein, 2007; Grierson und Schiefelbein, 2008).
Wurzelhaarspezifische morphogenetische Gene sind für die Wurzelhaarmorphogenese erforderlich und spielen eine Rolle bei der Zellwandorganisation, der Vesikelsekretion, der Signalübertragung und vielen anderen morphogenetischen zellulären Prozessen (Grierson und Schiefelbein, 2008).
In früheren Studien haben wir ROOT HAIR SPECIFIC (RHS) Gene identifiziert, die spezifisch in Wurzelhaarzellen exprimiert werden und an der Wurzelhaarmorphogenese beteiligt sind (Kim et al., 2006; Won et al., 2009). Die identifizierten RHS-Gene enthalten alle das 16- oder 17-bp-Wurzelhaar-spezifische Cis-Element (RHE) in ihren proximalen Promotorregionen (Kim et al., 2006; Won et al., 2009). RHEs sind in Angiospermen funktionell konserviert, um die wurzelhaarspezifische Genexpression zu regulieren, trotz Unterschieden im vorgelagerten Schicksalsbestimmungstyp (Kim et al., 2006). Dieser Befund legt nahe, dass die RHE-bindenden oder RHS-regulierenden Transkriptionsfaktoren auch in Angiospermen funktionell konserviert sind.
In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass RHD6 RSL4 (ein Homolog von RHD6) direkt reguliert, aber indirekt EXPANSIN A7 (EXPA7; ein RHS) reguliert (Yi et al., 2010). Die Transkriptomanalyse von Wildtyp-, rsl4-Mutanten und RSL4-überexprimierenden Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch, dass RSL4 die Expression vieler mit dem Wurzelhaar verwandter Gene, einschließlich RHS-Genen, hochreguliert (Yi et al., 2010).
In dieser Studie führten wir In-vitro- und In-vivo-Bindungsassays durch, um die Bindungsfähigkeit von RSL4 an die RHEs von RHS-Genen zu testen, und untersuchten die funktionelle Konservierung von RSL4 in der Tracheophyten (Gefäßpflanzen)-Linie durch Analyse der Funktion von Orthologen von RSL4 aus zwei Eudicots, ein Monocot und ein Lycophyte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass das RSL4-RHE-Regulationsmodul für die Wurzelhaarmorphogenese in Tracheophyten konserviert ist.
ERGEBNISSE
Wie bereits berichtet (Yi et al., 2010), wuchsen dem Sämling der rsl4-1-Mutante mit Funktionsverlust Wurzelhaare, die etwa 20 % der Länge der Kontrolle entsprachen. Die Komplementierung der rsl4-1-Mutante mit dem RSL4:GFP-Transgen unter der Kontrolle des RSL4-Promotors (ProRSL4) stellte das Wurzelhaarwachstum auf 68 % der Länge in der Kontrolle in der T2-Generation (Heterozygote plus Homozygote) und auf 95 % wieder her der Kontrolle in der T3-Generation (Homozygoten) . Die Überexpression von RSL4 mit dem ProRSL4:RSL4:GFP-Konstrukt im Wildtyp-Hintergrund erhöhte die Wurzelhaarlänge auf 112 % der Kontrolle. Die Überexpression von RSL4 unter dem starken Wurzelhaar-spezifischen EXPA7-Promotor (ProE7; Cho und Cosgrove, 2002; Kim et al., 2006) erhöhte das Wurzelhaarwachstum weiter auf bis zu 131 % der Kontrolllänge (ergänzende Abbildung 1 und ergänzender Datensatz 1). . In Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigten diese Daten, dass RSL4 ein positiver Effektor für das Wurzelhaarwachstum ist.
SL4 bindet an das RHE von RHS-Genen
Wir führten mehrere In-vitro- und In-vivo-Bindungsassays durch, um zu bestimmen, ob RSL4 an RHE bindet. In einem Hefe-Ein-Hybrid-Assay unter Verwendung einer Tandemsequenz von drei Kopien des RHE von EXPA7 (Kim et al., 2006)_ als Köder und RSL4 als Beute konnten Hefezellen in Gegenwart von 3-Amino- 1,2,4-Triazol im Triple-Dropout-Medium (TDO; -His/-Leu/-Trp) nur mit Beute und RHE-Köder, was darauf hindeutet, dass RSL4 an RHE in Hefezellen bindet. In einem Elektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) unter Verwendung der 61-bp-Promotorregion, einschließlich eines einzelnen RHE (Kim et al., 2006) aus dem Arabidopsis-PROLINE-RICH-PROTEIN3-(PRP3)-Gen als Sonde, die Zugabe von heterolog exprimierten RSL4-Proteinen verursachte eine typische Mobilitätsverschiebung der Sondenbande, und die Zugabe des unmarkierten Kompetitors schwächte die Intensität der verschobenen Sondenbande ab, was darauf hindeutet, dass RSL4 in vitro an RHE bindet. Das Kern-RHE-Motiv ist 16 oder 17 bp (Kim et al., 2006); dementsprechend testeten wir 19- bis 61-bp-Sondensequenzen, die ein 17-bp-RHE im Zentrum jeder Sequenz enthielten. Eine beträchtliche Bandenintensität wurde mit den Sonden von 23 bp und länger beibehalten, obwohl die 27-bp-Sonde eine verringerte Bandenintensität zeigte. Sonden, die kürzer als 23 bp waren, zeigten jedoch fast keine verschobene Bande, was darauf hinweist, dass mindestens ein Rand von 2 bp an beiden Enden des RHE-Kerns für die RSL4-Bindung notwendig ist.
Der RHE-Kern besteht aus einem 6-bp-linken Teil (LP) mit einem streng konservierten T-Nukleotid, einem 2- bis 3-bp-Linker und einem 8-bp-rechten Teil (RP) mit einer streng konservierten CACG-Sequenz, die a erzeugt 16- oder 17-bp-funktionelles RHE, abhängig von der RHE-Spezies. Jede einzelne Substitution in den streng konservierten Nukleotiden hebt die RHE-vermittelte wurzelhaarspezifische Genexpression fast vollständig auf, und eine einzelne Nukleotid-Deletions- und -Insertions-Mutation eines 3- bzw. 2-bp-Linkers beeinträchtigt die Funktion der RHE erheblich (Kim et al., 2006).
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Unter Verwendung von EMSA testeten wir, ob die Wirkung dieser RHE-Mutationen auf die wurzelhaarspezifische Expression durch die Hemmung der RSL4-Bindung an die mutierten RHEs verursacht wurde. Die Mutation des LP (mLP) verringerte die RSL4-Bindung erheblich, während die RP-Mutation (mRP) eine noch stärkere hemmende Wirkung auf die RSL4-Bindung zeigte . Mutationen sowohl des LP als auch des RP (mLPmRP) blockierten die RSL4-Bindung fast vollständig. Eine Deletion eines einzelnen Nukleotids im Linker (1-D) verringerte leicht die RSL4-Bindung. Dieses EMSA-Ergebnis zeigte eine Beziehung zwischen der Bindung von RSL4 an die RHE und der RHE-vermittelten wurzelhaarspezifischen Genexpression.